Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca preclinica, in cui gli studi di risposta ai farmaci nelle espianto di fette tumorali possono servire a scopi diagnostici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le espianto a fette possono per una breve finestra di tempo modellare la biologia complessa dei tessuti nativi, comprese le funzioni distribuite spazialmente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'uso di fette di tumori polmonari murini, può anche essere applicato ad altri tipi di tessuti tra cui tessuti umani.
Per iniziare, preparare il vibratomo ed eseguire un VibraCheck secondo le istruzioni fornite nel manuale. Quindi riempire ogni pozzo della piastra da 24 pozzetti con un millilitro della soluzione salina bilanciata di Hank integrata con penicillina e streptomicina e tenere la piastra sul ghiaccio. Inserire aghi calibro 25 in tutte e quattro le zampe di un topo eutanasiato posto su un coperchio di polistirolo in modo che il torace sia esposto e l'animale sia allungato.
Spruzzare 70% di alcol sulla superficie della pelle esposta. Utilizzare le forbici poste in posizione angolata per aprire la pelle dall'addome verso il torace e fino alla regione del collo. Allungare la pelle su entrambi i lati utilizzando pini e inserire aghi calibro 25.
Aprire la regione addominale. Quindi aprire la gabbia toracica e il diaframma per esporre il polmone e il cuore. Esporre la trachea tagliando via il tessuto circostante.
Sezionare i polmoni, insieme al cuore. Posizionare i tessuti in un tubo da 50 millilitri contenente 30 millilitri di HBSS ghiacciato integrato con Pen-Strep posto sul ghiaccio e procedere al passo successivo il più rapidamente possibile. Ora trasferisci i polmoni portanti il tumore in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri.
Utilizzare forbici sterili e forcep per separare i lobi polmonari e selezionare i lobi con tumori in superficie per l'affettamento. Posizionare un lobo polmonare con un tessuto tumorale su un pezzo di carta filtrante per evitare di scivolare e tagliare parte del normale polmone o tessuto tumorale aggiuntivo che circonda il tumore utilizzando un bisturi sterile per generare una superficie piana del pezzo di tessuto. Immergere il lato piatto in una goccia di adesivo cianoacrilato e montarlo sul supporto del campione del vibratomo in modo che il tumore affronti la lama in posizione verticale e lasciarla asciugare per due o tre minuti.
Posizionare il supporto del campione del vibratomo nel vassoio tampone metallico. Riempire il vassoio con HBSS freddo integrato con Pen-Strep fino a quando il tessuto non è immerso nel tampone. Coprire il vassoio tampone con il coperchio in plexiglas fornito con lo strumento e posizionare il vassoio in un bagno di ghiaccio bianco e aggiungere ghiaccio per mantenere il tessuto fresco durante l'affettamento.
Attaccare il bagno di ghiaccio bianco al vibratomo. Quindi selezionare le impostazioni di affezione adatte e iniziare a affeggiare. Portare la lama del vibratomo nella posizione di affettamento e impostare la finestra di affettamento.
Utilizzare forcep sterili per raccogliere le fette in una piastra da 24 pozzetti riempita con un millilitro di HBSS integrato con Pen-Strep per pozzo e tenere sul ghiaccio. Pur tenendo traccia dell'ordine di affettamento, contrassegnare ogni pozzo della piastra da 24 porsi secondo il piano sperimentale. Raccogliere una fetta di tessuto adiacente alle fette coltivate come zero ore o riferimento non coltivato.
Raccogliere almeno tre fette di riferimento per rappresentare la parte superiore, centrale e inferiore del tessuto. E una volta completato l'affezione, continuare con il fissaggio e l'elaborazione. Successivamente, preparare una piastra di sei porvili contenente 2,5 millilitri di terreno di coltura per pozzo posizionando vi griglie di titanio.
Assicurarsi che non si formano bolle d'aria tra la griglia in titanio e il mezzo. Per caricare una fetta sulla griglia, mantenere la piastra a sei pozzi in posizione angolata in modo che una parte del mezzo copra la griglia. Quindi posizionare la fetta nel mezzo sulla griglia e utilizzare le forcep per diffonderla.
Dopo aver posizionato le fette, caricare le piastre a sei porri sull'unità di incubazione rotante posizionata all'interno di un incubatore umidificato mantenuto a 37 gradi Celsius con 95%02 e 5%CO2. Avviare il ciclo di rotazione. Per la coltivazione a lungo termine ricostituire il mezzo di coltura ogni giorno utilizzando forcep sterili per sollevare la griglia contenente le fette di tessuto e posizionare in un pozzo vuoto del piatto a sei pozzi.
Sostituire il 70% del mezzo con un mezzo di coltura fresco e riposizionare la griglia. Continuare il ciclo di rotazione come in precedenza. Per il trattamento farmacologico sulle fette tumorali aggiungere 2,5 millilitri di media con il farmaco diluito o il controllo del veicolo nella piastra a sei pozzi.
Posizionare le griglie in titanio nei pozzi e quindi posizionare le fette sulle griglie come fatto in precedenza. Dopo aver eseguito i trattamenti per 24 ore, continuare con il fissaggio e la lavorazione. Per iniziare a fissare la fetta desiderata, trasferirla con cura utilizzando le forcep in una piastra di 10 centimetri contenente una carta filtrante imbevuta riempita con PBS da due a tre millilitri e lasciarla galleggiare.
Quindi sollevare la carta da filtro con un paio di forcep e posizionarla in una cassetta histo. Trasferire la carta filtrante in una cassetta histo. Aggiungere una goccia di ematossilina diluita sopra la fetta di tessuto per contrassegnare la posizione della fetta per i passaggi successivi.
Chiudere la cassetta e trasferirla in una soluzione di formalina tamponata neutra al 4% e lasciare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo il lavaggio e la lavorazione della cassetta come descritto nel protocollo, aprire la cassetta histo e utilizzare un bisturi per sollevare con cura la fetta fissa dalla carta filtrante. Scartare la carta da filtro e trasferire la fetta in uno stampo contenente paraffina liquida.
Utilizzare un peso piatto per premere il tessuto contro il fondo dello stampo di incorporamento per garantire una sezione uniforme. Posizionare la parte inferiore della cassetta histo sopra lo stampo. Aggiungere paraffina liquida sopra di esso.
E lasciare raffreddare lo stampo su una piastra fredda per 30 minuti. Successivamente separare lo stampo raffreddato dal blocco di paraffina. Utilizzare un microtomo per preparare sezioni sottili di quattro micrometri dei blocchi di fette di tessuto FFPE.
Tagliare via l'eccesso di paraffina che circonda il tessuto. Per ottenere sezioni pari in tutto il tessuto regolare l'angolo del blocco in modo che la superficie del blocco sia orientata orizzontalmente rispetto alla lama. Utilizzando un pennello sottile raccogliere sezioni di tessuto sequenziale della fetta di tessuto incorporata nella paraffina a partire dalla parte superiore dei vetrini.
Continuare a raccogliere le sezioni degli strati di tessuto più profondi al centro, seguite dalla parte inferiore delle diapositive di vetro. La raccolta di sezioni da diversi strati di ogni fetta di tessuto alle diapositive dell'oggetto viene eseguita per consentire l'acquisizione di potenziali gradienti indotti dalla coltura in vitalità, migrazione cellulare o espressione del biomarcatore. Dopo aver raccolto le sezioni continuano con la loro elaborazione e ulteriore analisi come descritto nel protocollo.
Lo spessore delle fette di tessuto può influenzare la vitalità delle fette coltivate. In questo caso, le fette spesse 250 micrometri mostrano un aumento dei gradienti di necrosi rispetto alle fette spesse 200 micrometri a causa di fette più spesse che diventano soggette a carenze di ossigeno o diffusione dei nutrienti attraverso le fette. Tuttavia, le fette sottili da 160 micrometri contengono grandi aree necrotiche probabilmente causate dalla manipolazione tecnica durante il posizionamento delle fette in quanto queste sono fragili e tendono ad arricciarsi.
L'analisi di NKX2-1, un marcatore di adenocarcinoma polmonare ben differenziato, mostra che la sua espressione non è significativamente alterata nelle fette coltivate rispetto alle fette non coltivate a zero ore. L'analisi quantitativa dell'espressione NKX2-1 ha inoltre confermato che l'espressione non è stata alterata in modo significativo nelle fette coltivate rispetto a quelle non coltivate, suggerendo che il processo di coltivazione non influisce visibilmente sullo stato di differenziazione del tessuto adenocarcinoma. Per verificare se le fette di tessuto tumorale possono essere utilizzate per valutare l'efficacia dei farmaci mirati, sono stati trattati con DMSO o quantità titole di composti.
Quando viene trattato con un dactolisib micromolare che prende di mira la fosforilazione della via mTOR di 4EBP1 è stato inibito. 0,5 selumetinib micromolare che si rivolge alla via MAP chinasi è stato efficace nell'inibire la fosforilazione di ERK1/2. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come lavorare e analizzare criticamente le fette appena tagliate da preziosi tessuti tumorali.
La nostra ex postdoc, Katja Narhi, ha contribuito in modo significativo alla creazione di questo metodo in collaborazione con i colleghi della piattaforma IMI Predect Consortium Tissue Slice.
