Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der präklinischen Forschung zu beantworten, wo Arzneimittelreaktionsstudien in Tumorscheibenexplanten diagnostischen Zwecken dienen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Slice-Explants für ein kurzes Zeitfenster die komplexe Biologie nativer Gewebe einschließlich räumlich verteilter Funktionen modellieren können. Obwohl diese Methode Einblick in die Verwendung von Scheiben aus murinen Lungentumoren bieten kann, Kann es auch auf andere Gewebetypen einschließlich menschlicher Gewebe angewendet werden.
Bereiten Sie zunächst das Vibratome vor und führen Sie einen VibraCheck gemäß den Anweisungen im Handbuch durch. Dann füllen Sie jeden Brunnen der 24-Well-Platte mit einem Milliliter Hanks Balanced Salzlösung, ergänzt mit Penicillin und Streptomycin und halten Sie die Platte auf Eis. Legen Sie 25-Spur-Nadeln in alle vier Pfoten einer eingeschläferten Maus auf einen Styropordeckel, so dass die Brust ausgesetzt und das Tier gedehnt wird.
Sprühen Sie 70% Alkohol auf die Oberfläche der exponierten Haut. Verwenden Sie eine Schere in einer abgewinkelten Position, um die Haut vom Bauch zur Brust und bis zum Halsbereich zu schneiden. Dehnen Sie die Haut auf beiden Seiten mit Zangen und setzen Sie 25-Spur-Nadeln ein.
Den Bauchbereich aufschneiden. Dann den Rippenkäfig und das Zwerchfell aufschneiden, um Die Lunge und das Herz freizulegen. Setzen Sie die Luftröhre aus, indem Sie das umgebende Gewebe abschneiden.
Sezieren Sie die Lunge zusammen mit dem Herzen. Legen Sie das Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre mit 30 Millilitereisis HBSS, ergänzt durch Pen-Strep auf Eis gelegt und gehen Sie so schnell wie möglich zum nächsten Schritt. Übertragen Sie nun die tumortragende Lunge in eine 10-Zentimeter-Gewebekulturplatte.
Verwenden Sie sterile Schere und Zangen, um die Lungenlappen zu trennen und Lappen mit Tumoren an der Oberfläche zum Schneiden auszuwählen. Legen Sie einen Lungenlappen mit einem Tumorgewebe auf ein Stück Filterpapier, um ein Verrutschen zu vermeiden und einen Teil der normalen Lunge oder zusätzliches Tumorgewebe, das den Tumor umgibt, mit einem sterilen Skalpell auszuschneiden, um eine flache Gewebestückoberfläche zu erzeugen. Tauchen Sie die flache Seite in einen Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff und montieren Sie sie auf den Vibratom-Probenhalter, so dass der Tumor der Klinge in aufrechter Position gegenübersteht, und lassen Sie sie zwei bis drei Minuten trocknen.
Legen Sie den Vibram-Probenhalter in die Metallpufferschale. Füllen Sie das Tablett mit kaltem HBSS, ergänzt durch Pen-Strep, bis das Gewebe in den Puffer eingetaucht ist. Bedecken Sie die Pufferschale mit dem Plexiglasdeckel, der mit dem Instrument geliefert wird, und legen Sie das Tablett in ein weißes Eisbad und fügen Sie Eis hinzu, um das Gewebe während des Schneidens kühl zu halten.
Befestigen Sie das weiße Eisbad am Vibratome. Wählen Sie dann die passenden Schnitteinstellungen aus und beginnen Sie mit dem Schneiden. Bringen Sie die Vibratomklinge in die Schnittposition und stellen Sie das Schneidfenster ein.
Verwenden Sie sterile Zangen, um die Scheiben in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter HBSS ergänzt mit Pen-Strep pro Brunnen gefüllt zu sammeln und auf Eis zu halten. Markieren Sie bei der Verfolgung der Schnittreihenfolge jeden Brunnen der 24-Well-Platte gemäß dem Versuchsplan. Sammeln Sie eine Gewebescheibe neben den kultivierten Slices als Null-Stunden- oder unkultivierte Referenz.
Sammeln Sie mindestens drei Referenzscheiben, um die Ober-, Mittel- und Unterseite des Gewebes darzustellen. Und sobald das Schneiden abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Befestigung und Verarbeitung fort. Danach bereiten Sie eine Sechs-Brunnen-Platte mit 2,5 Milliliter Kulturmedium pro Brunnen vor, indem Sie Titangitter darin platzieren.
Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem Titangitter und dem Medium gebildet werden. Um eine Scheibe auf das Gitter zu laden, halten Sie die Sechs-Well-Platte in einer abgewinkelten Position, so dass ein Teil des Mediums das Gitter bedeckt. Legen Sie dann die Scheibe im Medium auf das Gitter und verwenden Sie Zangen, um sie zu verbreiten.
Nach dem Platzieren der Scheiben die Sechs-Brunnen-Platten auf die rotierende Inkubationseinheit laden, die in einem befeuchteten Inkubator platziert ist, der bei 37 Grad Celsius bei 95%02 und 5% CO2 gehalten wird. Starten Sie den Rotationszyklus. Für den langfristigen Anbau füllen Sie das Kulturmedium jeden Tag auf, indem Sie sterile Zangen verwenden, um das Gitter mit den Gewebescheiben zu heben und in einen leeren Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte zu legen.
Ersetzen Sie 70 % des Mediums durch ein frisches Kulturmedium, und platzieren Sie das Raster wieder ein. Setzen Sie den Rotationszyklus wie zuvor fort. Zur medikamentösen Behandlung auf den Tumorscheiben fügen Sie 2,5 Milliliter Medien mit dem verdünnten Medikament oder Fahrzeugkontrolle in die Sechs-Brunnen-Platte.
Legen Sie die Titangitter in die Brunnen und legen Sie die Scheiben dann wie zuvor auf die Gitter. Nach der Durchführung der Behandlungen für 24 Stunden, fahren Sie mit der Fixierung und Verarbeitung fort. Um die gewünschte Scheibe sorgfältig zu fixieren, übertragen Sie sie vorsichtig mit Zangen in eine 10-Zentimeter-Platte mit einem eingeweichten Filterpapier, das mit zwei bis drei Millilitern PBS gefüllt ist, und lassen Sie es schweben.
Heben Sie dann das Filterpapier mit einer Zange heraus und legen Sie es in eine Histo-Kassette. Übertragen Sie das Filterpapier in eine Histokassette. Fügen Sie einen Tropfen verdünntes Hämatoxylin auf die Gewebescheibe, um die Position der Scheibe für die nachfolgenden Schritte zu markieren.
Schließen Sie die Kassette, und übertragen Sie sie in 4%neutral gepufferte Formalin-Lösung und lassen Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen und Verarbeiten der Kassette, wie im Protokoll beschrieben, öffnen Sie die Histo-Kassette und verwenden Sie ein Skalpell, um die feste Scheibe vorsichtig aus dem Filterpapier zu heben. Entsorgen Sie das Filterpapier und übertragen Sie die Scheibe in eine Form, die flüssiges Paraffin enthält.
Verwenden Sie ein flaches Gewicht, um das Gewebe gegen den Boden der Einbettform zu drücken, um eine gleichmäßige Schnittbildung zu gewährleisten. Legen Sie den unteren Teil der Histo-Kassette auf die Form. Fügen Sie flüssiges Paraffin darauf.
Und lassen Sie die Form auf einer kalten Platte für 30 Minuten abkühlen. Danach trennen Sie die gekühlte Form vom Paraffinblock. Verwenden Sie ein Mikrotome, um vier Mikrometer dünne Abschnitte der FFPE-Gewebescheibenblöcke vorzubereiten.
Schneiden Sie den Überschuss an Paraffin, der das Gewebe umgibt, weg. Um gleichmäßige Abschnitte im gesamten Gewebe zu erhalten, passen Sie den Winkel des Blocks so an, dass die Oberfläche des Blocks horizontal in Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist. Mit einer dünnen Bürste sammeln sequentielle Gewebeabschnitte der Paraffin-eingebetteten Gewebescheibe beginnend am oberen Teil der Glasgleitet.
Sammeln Sie die Abschnitte der tieferen Gewebeschichten in der Mitte weiter, gefolgt vom unteren Teil der Glasgweise. Die Sammlung von Abschnitten aus verschiedenen Schichten jedes Gewebesegments zu den Objektfolien wird durchgeführt, um die Erfassung potenzieller kulturinduzierter Gradienten in Lebensfähigkeit, Zellmigration oder Biomarker-Expression zu ermöglichen. Nach dem Sammeln der Abschnitte wird mit der Verarbeitung und weiteren Analyse, wie im Protokoll beschrieben, fortgesetzt.
Die Dicke der Gewebescheiben kann die Lebensfähigkeit kultivierter Scheiben beeinflussen. In diesem Fall weisen 250 Mikrometer dicke Scheiben erhöhte Nekrosegradienten auf, verglichen mit 200 Mikrometer dicken Scheiben, da dickere Scheiben anfällig für Sauerstoff- oder Nährstoffdiffusionsstörungen in den Scheiben werden. Jedoch, 160-Mikrometer dünne Scheiben enthalten große nekrotische Bereiche wahrscheinlich durch technische Handhabung während der Positionierung der Scheiben verursacht, da diese zerbrechlich sind und neigen dazu, zu krümmen.
Die Analyse von NKX2-1, einem Marker für gut differenziertes Lungenadenokarzinom, zeigt, dass seine Expression in kultivierten Scheiben im Vergleich zu nullstündigen unkultivierten Scheiben nicht signifikant verändert wird. Die quantitative Analyse des NKX2-1-Expressions bestätigte ferner, dass der Ausdruck in kultivierten und unkultivierten Scheiben nicht signifikant verändert wurde, was darauf hindeutet, dass der Kultivierungsprozess den Differenzierungsstatus des Adenokarzinomgewebes nicht sichtbar beeinflusst. Um zu testen, ob Tumorgewebescheiben verwendet werden können, um die Wirksamkeit von gezielten Medikamenten zu bewerten, wurden sie mit DMSO oder titrierten Mengen von Verbindungen behandelt.
Bei Behandlung mit einem Mikromolaren Dactolisib, das auf den mTOR-Signalweg abzielt, wurde die Phosphorylierung von 4EBP1 gehemmt. 0,5 mikromolare selumetinib, die auf den MAP-Kinase-Signalweg abzielt, war wirksam bei der Hemmung der Phosphorylierung von ERK1/2. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Schnitten arbeiten und kritisch analysieren, die frisch aus wertvollem Tumorgewebe geschnitten wurden.
Unsere ehemalige Postdoc,Katja Narhi, hat maßgeblich zur Etablierung dieser Methode in Zusammenarbeit mit Kollegen der IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform beigetragen.
