Этот протокол заполняет технический пробел в нашей способности генерировать ультра-длинные массивы последовательности. Это позволяет нам исследовать сложность генома, которая ограничена современными подходами к короткому считытию в геномике. Метод уникален по производительности, надежности, универсальности и потенциалу интеграции с перспективными новыми приложениями.
Он применим к различным материалам и может модулироваться для различных мгновенных размеров. Этот метод начал революцию в клиническом ландшафте. Его полезность диагностики в повторных расстройств расширения преодолела многие текущие недостатки.
Некоторые регистры трансплантации использовали HLA-типирование высокого разрешения для лучшего клинического исхода. Эти методы предоставляют ранее недоступную информацию дальнего радиуса действия, такую как поэтапное и сложное структурное отклонение. В сочетании с эпигенетическим считыванием в одном тесте, это позволит точной медицины.
Это длинный протокол со многими новыми методами, и трудно понять, работает ли он до окончательного последовательности. Я рекомендую практиковать нагрузку на старые ячейки потока перед запуском образцов. Сотрудники говорят, что некоторые методы сбивают с толку по сравнению с короткочитаемые подходы.
В частности, экстракция мягче из-за высокого качества, высокоя молекулярного веса ДНК. Для начала извлечения ДНК HMW сначала добавьте 200 микролитров клеточной подвески в 10 миллилитров буфера лиза в 50 миллилитровую трубку. Затем вихрь на максимальной скорости в течение трех секунд.
И инкубировать раствор при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. В конце инкубации добавьте к лизате два микролитера RNS-A. Аккуратно поверните 50 миллилитровую трубку, чтобы смешать образец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
После инкубации добавьте в лизат 10 миллилитров фенолового слоя фенол-хлороформ-изоамиловой спиртовой смеси. И положить трубку на ротатор при 20 об/мин в течение 10 минут под капотом дыма. После центрифугации гелевых трубок тщательно вылейте супернатант в новую 50-миллилитровую трубку.
Затем добавьте 25 миллилитров ледяного 100% этанола и аккуратно поверните трубку вручную, пока ДНК не осаждается. Согните 20 микролитровый наконечник, чтобы сделать крюк. Используя крючок, осторожно вынул ДНК HMW и пусть жидкость упасть.
Затем поместите ДНК в 50 миллилитровую трубку, содержащую 40 миллилитров этанола 70%, и аккуратно инвертировать трубку три раза, чтобы вымыть ДНК. Чтобы подготовить библиотеку на основе механического стрижки, сначала используйте шприц без иглы 100 миллилитров, чтобы проработать всю ДНК. Затем положите 27-го калибра иглы на шприц и извлечь все ДНК в блюдо мягко и медленно.
Повторите 29 раз. Затем добавьте в трубку 143 микролитера повторно подвешенных магнитных бусин и 143 микролитров смеси реакции ДНК. Флик трубки шесть раз, чтобы смешать осторожно, и положить трубку на ротатор при 20 об / мин в течение 30 минут.
Центрифуга трубки на 1000G в течение двух секунд при комнатной температуре, чтобы спина вниз образца, а затем поместить трубку на магнитной стойке в течение 10 минут. Затем отбросьте супернатант, пока трубка все еще на стойке. Добавьте 400 микролитров свежеприготовленного 70% этанола.
Подождите 30 секунд. А затем удалить этанол. Затем центрифуга трубки на 1000G в течение двух секунд при комнатной температуре, чтобы спина вниз образца.
Поместите трубку обратно на магнитную стойку и удалите остаточный этанол. Высушите гранулы в течение 30 секунд. Затем снимите трубку с магнитной стойки и добавьте 103 микролитров буфера T-E.
Затем аккуратно щелкнуть трубку, чтобы убедиться, что бусы покрыты буфером и положить трубку на ротатор при комнатной температуре в течение 30 минут. Наконец, поместите трубку обратно на магнитную стойку в течение 10 минут, чтобы гранулы бисера. Используйте P200 широкий наконечник скважины для передачи 100 микролитров элуата в 0,2 миллилитровую трубку, и приступить к конечному ремонту ДНК-хвост и адаптер перевязки реакций.
Чтобы подготовить библиотеку на основе фрагментации транспозазы, сначала сделайте реакцию тегментации ДНК, добавив 22 микролитров ДНК HMW, один микролитр из 10 миллимолейных трисов, рН 8, с 0,02%Triton X-100 и 1 микролитр смеси фрагментации, до 0,2 миллилитровой трубки. Далее, используйте P200 широкий кончик скважины, чтобы смешать реакцию шесть раз, и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение одной минуты, а затем 80 градусов по Цельсию в течение одной минуты. Держите при четырех градусах по Цельсию.
Наконец, используйте P200 широкий кончик скважины для передачи реакции на 1,5 миллилитровую трубку и быстро добавить 1 микролитр быстрого адаптера смеси. Используйте P200 широкий кончик скважины, чтобы смешать реакцию шесть раз. Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение одного часа, и приступить к последовательности.
Чтобы начать секвенирование, сначала вставьте новую ячейку потока в один из каналов устройства Nanopore. Затем, на сопроводительном программном обеспечении управления секвенированием, проверьте поле расположения ячейки потока. Выберите правильный тип ячейки потока и нажмите на рабочий процесс ячейки потока проверки.
Нажмите на кнопку запуска теста, чтобы начать анализ потока ячейки КК. Далее, с P1000 пипетки установлен на 100 микролитров, отступить менее 30 микролитров буфера для удаления пузырьков из потока ячейки. Добавьте 30 микролитров грунтовки, чтобы покрыть верхнюю часть грунтовки порта, чтобы избежать введения пузырьков.
Затем пипетка 800 микролитров грунтовки смешиваются в грунтовочном порту для загрузки ячейки потока. Вынюйте наконечник, когда есть около 50 микролитров грунтовки смесь слева, и добавить остальную часть грунтовки смесь на вершине грунтовки порта. Затем, с P1000 пипеткой, добавьте 200 микролитров грунтовки смеси в ячейку потока.
Затем, непосредственно перед погрузкой, используйте P200 пипетки набор до 80 микролитров для пипетки вверх и вниз по библиотеке ДНК шесть раз. Наконец, загрузите библиотечную смесь в ячейку потока через порт выборки и приступайте к секвенированию и анализу данных. КК анализ ДНК готовы к механической стрижки основе библиотечной конструкции привело к 260 до 280 соотношение чистоты примерно 1,9, и 260 до 230 соотношение примерно 2,3, показывая хороший образец ДНК.
Тот же результат был замечен с использованием ДНК готовы к транспозазы фрагментации на основе библиотечной конструкции. Контроль качества иглы с помощью импульсного поля гель-электрофорез показал, что большая часть ДНК HMW была больше 50 килобазы. Результаты четырех запусков с использованием ячейки HG00733 показали, что N50 библиотеки на основе механического стрижки был короче, чем библиотека на основе фрагментации транспозазы.
Кроме того, все четыре трассы имели более 2300 считых с длиной более 100 килобаза. Максимальная длина была больше в библиотеках на основе фрагментации транспозазы с более коротким временем подготовки, по сравнению с библиотеками на основе механического стрижки. Библиотеки на основе механического стрижки производили больше общих считывания по сравнению с библиотеками на основе фрагментации транспозазы, что свидетельствует о более высокой урожайности.
Обе библиотеки показали стабильное высокое качество, и более 97% их общих оснований были приведены в соответствие с геномом человека. Ожидаемые распределения размеров показали, что все четыре трассы имели большую долю данных свыше 50 килосаз, в то время как библиотеки на основе фрагментации транспонзы имели более высокое соотношение ультра-длинных считывай. Общая цель состоит в том, чтобы сохранить ДНК нетронутыми, поэтому важно, чтобы избежать каких-либо суровых обработки ДНК.
Ключевым фактором, который может максимизировать значение метода, является вычислительный анализ. Наша команда разработала долгосрочный аналитический конвейер под названием PICKY, который может обнаружить полный спектр внедорожников с высокой чувствительностью. Это откроет новые возможности для захватывающих областей, таких как обнаружение сложных SVs и поэтапной перестановки и модификации на уровне одной молекулы.
Это значительно улучшит наше понимание архитектуры генома. Фенол очень коррозионный. Вы должны работать с ним в дымовой капот с личным защитным оборудованием, в том числе перчатки, защитные очки, лабораторное пальто, длинные брюки и обувь.
