Ce protocole comble une lacune technique dans notre capacité à générer des tableaux de séquences ultra-longs. Il nous permet d’examiner la complexité du génome qui est limitée par les approches actuelles à courte lecture en génomique. La méthode est unique en termes de performances, de robustesse, de polyvalence et de potentiel d’intégration à de nouvelles applications prometteuses.
Il s’applique à différents matériaux et peut être modulé pour différentes tailles instantanées. Cette technique a commencé à révolutionner le paysage clinique. Son utilité de diagnostic dans les désordres répétés d’expansion a surmonté beaucoup de lacunes actuelles.
Certains registres de transplantation ont utilisé le dactylographie HLA haute résolution pour de meilleurs résultats cliniques. Ces méthodes fournissent des informations à longue portée auparavant inaccessibles telles que l’élimination progressive et la variance structurale complexe. Couplé à la lecture épigénétique en un seul test, il permettra la médecine de précision.
C’est un long protocole avec beaucoup de nouvelles techniques et il est difficile de savoir si cela fonctionne jusqu’au séquençage final. Je recommande de pratiquer le chargement sur les vieilles cellules d’écoulement avant d’exécuter des échantillons. Les collaborateurs ont dit que certaines techniques sont déroutantes par rapport aux approches à courte lecture.
Plus précisément, l’extraction est plus douce en raison de la haute qualité, l’ADN de poids moléculaire élevé. Pour commencer l’extraction de l’ADN HMW, ajoutez d’abord 200 microlitres de la suspension cellulaire à 10 millilitres de tampon de lyse dans un tube de 50 millilitres. Puis, vortex à la vitesse la plus élevée pendant trois secondes.
Et incuber la solution à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, ajouter deux microlitres de RNS-A au lysate. Faites pivoter doucement le tube de 50 millilitres pour mélanger l’échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Après l’incubation, ajouter 10 millilitres de la couche phénol du mélange d’alcool phénol-chloroforme-isoamyle au lysate. Et mettre le tube sur un rotateur à 20 rpm pendant 10 minutes sous un capot de fumée. Après centrifugation avec des tubes de gel, versez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Ajouter ensuite 25 millilitres d’éthanol glacé à 100 % et faire pivoter doucement le tube à la main, jusqu’à ce que l’ADN se précipite. Pliez une pointe de 20 microlitres pour faire un crochet. À l’aide du crochet, retirer soigneusement l’ADN hmw et laisser tomber le liquide.
Ensuite, placez l’ADN dans un tube de 50 millilitres contenant 40 millilitres de 70% d’éthanol, et inversez doucement le tube trois fois pour laver l’ADN. Pour préparer la bibliothèque mécanique à base de cisaillement, utilisez d’abord une seringue sans aiguille de 100 millilitres pour aspirer tout l’ADN. Ensuite, mettez une aiguille de calibre 27 sur la seringue et éjectez tout l’ADN dans le plat doucement et lentement.
Répéter 29 fois. Ensuite, ajoutez 143 microlitres des perles magnétiques re-suspendues et 143 microlitres du mélange de réaction de réparation d’ADN à un tube. Feuilletez le tube six fois pour mélanger doucement, et mettez le tube sur un rotateur à 20 rpm pendant 30 minutes.
Centrifugez le tube à 1000G pendant deux secondes à température ambiante pour faire tourner l’échantillon, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant 10 minutes. Ensuite, jetez le supernatant pendant que le tube est encore sur la grille. Ajouter 400 microlitres de l’éthanol fraîchement préparé à 70 %.
Attendez 30 secondes. Et puis enlever l’éthanol. Ensuite, centrifugez le tube à 1000G pendant deux secondes à température ambiante pour faire tourner l’échantillon.
Remettre le tube sur la grille magnétique et retirer tout éthanol résiduel. Sécher à l’air le granulé pendant 30 secondes. Ensuite, retirez le tube de la grille magnétique et ajoutez 103 microlitres de tampon T-E.
Ensuite, faites glisser doucement le tube pour vous assurer que les perles sont couvertes dans le tampon et placez le tube sur le rotateur à température ambiante pendant 30 minutes. Enfin, remettre le tube sur la grille magnétique pendant 10 minutes pour pelleter les perles. Utilisez une pointe de forage large P200 pour transférer 100 microlitres de l’allongement à un tube de 0,2 millilitre, et procéder à la réparation finale dA-tailing et adaptateur réactions ligature.
Pour préparer la bibliothèque à base de fragmentation de la transposase, faites d’abord une réaction de tagmentation de l’ADN en ajoutant 22 microlitres de l’ADN HMW, un microlitre de Triss de 10 millimolaires, pH 8, avec 0,02% Triton X-100, et 1 microlitre du mélange de fragmentation, à un tube de 0,2 millilitre. Ensuite, utilisez une pointe d’alésage de large P200 pour mélanger la réaction six fois, et incuber à 30 degrés Celsius pendant une minute, suivie de 80 degrés Celsius pendant une minute. Tenez-vous à quatre degrés Celsius.
Enfin, utilisez une pointe d’alésage large P200 pour transférer la réaction à un tube de 1,5 millilitre et ajouter rapidement 1 microlitre de mélange adaptateur rapide. Utilisez une pointe d’alésage de large P200 pour mélanger la réaction six fois. Incuber la réaction à température ambiante pendant une heure et procéder au séquençage.
Pour commencer le séquençage, insérez d’abord une nouvelle cellule d’écoulement dans l’un des canaux de l’appareil Nanopore. Ensuite, sur le logiciel de contrôle de séquençage qui l’accompagne, cochez la case de localisation de la cellule d’écoulement. Sélectionnez le bon type de cellule d’écoulement et cliquez sur le flux de travail de la cellule de contrôle.
Cliquez sur le bouton de test de démarrage pour démarrer l’analyse qc cellule d’écoulement. Ensuite, avec une pipette P1000 réglée sur 100 microlitres, retirez moins de 30 microlitres de tampon pour éliminer les bulles de la cellule d’écoulement. Ajouter 30 microlitres du mélange d’amorçage pour couvrir le dessus du port d’amorçage pour éviter d’introduire des bulles.
Ensuite, pipette 800 microlitres du mélange d’amorçage dans le port d’amorçage pour charger la cellule d’écoulement. Sortez la pointe lorsqu’il reste environ 50 microlitres du mélange d’amorçage et ajoutez le reste du mélange d’amorçage sur le dessus du port d’amorçage. Ensuite, avec une pipette P1000, ajouter 200 microlitres du mélange d’amorçage dans la cellule d’écoulement.
Puis, juste avant le chargement, utilisez une pipette P200 réglée sur 80 microlitres pour monter et descendre la bibliothèque d’ADN six fois. Enfin, chargez le mélange de bibliothèque dans la cellule d’écoulement à travers le port de l’échantillon, et procédez au séquençage et à l’analyse des données. L’analyse qc de l’ADN prêt pour la construction mécanique de bibliothèque à base de cisaillement a eu comme conséquence le rapport de pureté de 260 à 280 d’approximativement 1.9, et le rapport 260 à 230 d’approximativement 2.3, montrant un bon échantillon d’ADN.
Le même résultat a été observé à l’aide de la construction de bibliothèques à fragmentation prêtes à être transposées par l’ADN. Le contrôle de qualité de taille de l’ADN de HMW aiguille-cisaillé par l’électrophoresis de gel de champ d’impulsion a prouvé que la majorité de l’ADN de HMW était plus grand que 50 kilobases. Les résultats de quatre séries utilisant la cellule HG00733 ont montré que le N50 d’une bibliothèque mécanique à base de cisaillement était plus court qu’une bibliothèque à fragmentation de transposase.
En outre, les quatre pistes avaient plus de 2300 lectures avec une longueur de plus de 100 kilobases. La longueur maximale était plus longue dans les bibliothèques à fragmentation de transposase avec son temps de préparation plus court, par rapport aux bibliothèques mécaniques à base de cisaillement. Les bibliothèques mécaniques à base de cisaillement ont produit des lectures plus totales par rapport aux bibliothèques à fragmentation de transposase, ce qui indique un rendement plus élevé.
Les deux bibliothèques ont montré une qualité constante et plus de 97% de leurs bases totales ont été alignées avec le génome de référence humain. Les distributions de taille prévues ont montré que les quatre séries avaient une grande proportion de données supérieures à 50 kilobases, tandis que les bibliothèques à fragmentation de transposase avaient un ratio plus élevé de lectures ultra-longues. L’objectif global est de garder l’ADN intact, il est donc important d’éviter toute manipulation sévère de l’ADN.
Un facteur clé qui peut maximiser la valeur de la méthode est l’analyse computationnelle. Notre équipe a mis au point un pipeline d’analyse à long terme appelé PICKY qui peut détecter une gamme complète de VUS à haute sensibilité. Il ouvrira de nouvelles voies à des domaines passionnants comme la détection de SVs complexes et les réarrangements et modifications progressives au niveau de la molécule unique.
Cela améliorera considérablement notre compréhension de l’architecture du génome. Le phénol est très corrosif. Vous devez travailler avec elle dans une hotte de fumée avec de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité, un manteau de laboratoire, des pantalons longs et des chaussures.
