NGF送到大脑是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种新型的载体，允许生物活性蛋白的安全和长期释放。该技术允许将NGF简单、高效地加载到多孔硅载体中。
它在室温下进行，不使用强有机溶剂。由于多孔硅载体设计可调，载体可以长期作为NGF储液罐植入物，但也可以进行改性以携带其他因素和药物。对于工程师和化学家来说，制造过程可能更容易执行。
而对于生命科学家和临床医生来说，细胞培养程序应该相对简单易用。首先，将具有良好特征的电阻率的一点五点五厘米硅片安装到多特氟乙烯蚀刻单元中，使用铝箔条作为背面接触体和 O 形环来密封电池。该织物可重新用于每次具有类似电阻率值的硅晶片。
以三比一的亚克卢斯氢氟酸和乙醇溶液中电化学蚀刻硅样品 20 秒，恒定电流密度为每厘米 250 毫安。然后用乙醇冲洗产生的多孔硅膜的表面三次，然后在氮气流下干燥。当样品干燥时，在800摄氏度的管炉中热氧化管炉中新鲜蚀刻的多孔硅样品，在环境空气中加热一小时，形成氧化多孔硅支架。
当样品冷却后，使用切锯将样品切成八由八毫米的样品。要用NGF装载样品，在每个样品上分配52微升新鲜制备的NGF装载溶液，并在高湿度条件下的覆盖盘中在室温下孵育样品两小时。两小时后，在样品上收集溶液，将NGF装载溶液和收集的后装液溶液样品稀释到伊利扎试剂盒的适当浓度范围内。
当所有样品都稀释后，在校准曲线样品中加入100微升稀释样品，将NGF捕获抗体涂层的96井伊利扎板的每个井添加到室温下孵育两小时。在孵育结束时，清洗板四次，在每一升生物活性检测抗体中加入一百微升，在室温下孵育两小时。四次洗涤后，如证明，在每一个井中加入100微升的Avidin-Horseradish过氧化物，在室温下孵育30分钟，随后在洗涤缓冲液中进行4次洗涤。
上次洗涤后，在每井中加入100微升基板溶液，在室温下进行25分钟的颜色发育孵化。然后使用微孔板读卡器测量 405 纳米的吸光度，波浪长度校正设置为 650 纳米，并基于校准曲线确定加载溶液和收集的后装载溶液中的 NGF 浓度。对于在 Vitro NGF 释放中，在两毫升零点零一摩尔 PBS 中孵育 NGF 加载的氧化多孔硅载体，辅以零点零零二的 2% 的硫化钠，在 37 摄氏度和每分钟 100 次轨道调整中旋转。
每两天收集一次溶液，每次吸气后用两毫升新鲜 PBS 代替。然后将收集的释放样品冻结在液氮中，储存零下20摄氏度，直到伊利扎对NGF进行分析，正如刚刚证明的。要产生分化的 feo cromo 坐膜 12 或 PC 12， 细胞培养， 收集细胞悬浮通过感性三联和重新悬浮细胞在五毫升新鲜基本生长介质.
第二次发送后，将味觉重新悬浮在三毫升的基本生长介质中，并使用 23 量表注射器对细胞吸气 10 次，以分离任何细胞簇。计数后，种子1倍10至第四细胞每厘米平方工作面积在科利根类型一涂层板存在分化介质。将盘子放在培养箱中。
24小时后，在37摄氏度下添加新鲜的murineβNGF或NGF加载多孔硅载体到每个板，并返回板到孵化器。为了评估细胞的生存能力，在37摄氏度的代表性时间点用10%的适当可行性指标溶液孵育培养素，并在37摄氏度下测量光谱仪上的吸收度，其波长度校正设置为630纳米。为了评估在NGF加载的多孔硅载体存在的情况下的PC 12细胞分化，在12个低胶原蛋白涂层板中对PC 12细胞进行24小时的种子，并介绍先前获得的体外释放样品到适当的实验井。
经过24小时的孵育，通过光显微镜对细胞进行成像，并手动计算每个井中含烷黄酸盐的细胞数量。用于分化 PC 12 细胞的形态测量分析，在使用 NGF 治疗后三天内获取培养细胞的相位图像，并打开神经元 J.将图像文件转换为 8 位格式，并使用图像比例尺测量像素与千分米的比例。使用分析和设置比例来设置比例并测量每个神经石的长度。
然后手动计算分支点的数量和来自每个细胞 soma 的 nourites 数。显示了由此产生的氧化多孔硅膜的高分辨率扫描电子显微镜图像。薄膜的顶视图显微图揭示了其高度多孔的性质，孔径约为40纳米。
切割薄膜的横截面显微图显示两点九微米的多孔层厚度，其特点是连接圆柱形孔隙。与发布期后期的发布速度慢得多相比，在发布期后几天，持续释放 NGF 无突发效果的天数为一个月，而 NGF 的释放速度会更快。使用NGF加载的多孔硅载体进行治疗，诱导在PC 12细胞培养物中特征分神经元网络中形成中性。
请注意，即使26天后，释放的NGF诱导细胞分化超过50%，表明NGF在多孔宿主内的诱捕能保留蛋白质的生物活性约一个月。在第一天和三天对NGF加载多孔硅处理细胞群进行形态测量分析表明，使用NGF加载多孔硅处理的PC 12细胞表现出与所测试的所有三种参数在受控处理培养中观察到的形态测量值相似。遵循和充分履行介绍的步骤将为您提供一个有利的NGF交付系统，能够维持神经元细胞的生存和分化。
我们目前正在研究使用NGF多孔硅载体作为长期释放植入大脑，以研究其正常的保护作用，并了解退行性疾病，如阿尔茨海默病。按照这个程序，NGF加载多孔硅载体对果糖木坏血细胞正常生长的影响也可以研究。多孔硅是一种很有前途的纳米材料，可用于各种应用。
除了此处介绍的，包括生物或化学传感器、诊断和成像。要排除多孔硅载体对细胞系的任何潜在毒性，请务必执行可分离性分文并消毒多孔硅样品。
