NGF livré au cerveau est difficile. Ici, nous présentons un nouveau type de transporteur qui permet une libération sûre et prolongée de la protéine bioactive. Cette technique permet une charge simple et efficace de NGF dans les porteurs poreux de silicium.
Il est effectué à température ambiante et sans utiliser de solvants organiques solides. Comme la conception poreuse du porte-silicium est tunable les transporteurs peuvent servir d’implants réservoir NGF pour une libération à long terme, mais peut également être modifié pour transporter d’autres facteurs et médicaments. Pour les ingénieurs et les chimistes, le processus de fabrication peut être plus facile à exécuter.
Alors que pour les scientifiques et cliniciens à vie, les procédures de culture cellulaire devraient être relativement simples à reproduire. Commencez par monter une gaufrette de silicium d’un point cinq par un point de cinq centimètres avec une résistivité bien caractérisée dans une cellule de gravure d’éthaline polytetrafluro utilisant une bande de papier d’aluminium comme contact arrière et un o-ring pour sceller la cellule. Le tissu est représentable pour les plaquettes de silicium d’utilisation avec des valeurs de résistivité similaires à chaque fois.
Électrochimiquement graver l’échantillon de silicium dans une solution de trois à un d’acide fluorhydrique akleus et d’éthanol pendant 20 secondes à une densité actuelle constante de 250 milliamps par centimètre carré. Rincez ensuite la surface du film de silicium poreux résultant avec de l’éthanol trois fois avant de sécher sous un flux d’azote. Lorsque l’échantillon est sec, oxyder thermiquement l’échantillon de silicium poreux fraîchement gravé dans le four à tubes à 800 degrés Celsius pendant une heure dans l’air ambiant pour former un échafaudage poreux oxydé de silicium.
Lorsque l’échantillon est refroidi, utilisez une scie à découper pour la couper en un échantillon de huit par huit millimètres. Pour charger les échantillons de NGF, distribuez 52 microlitres de solution de chargement NGF fraîchement préparée sur chaque échantillon et incubez les échantillons pendant deux heures à température ambiante dans un plat couvert dans des conditions d’humidité élevée. Après deux heures, recueillir la solution sur le dessus des échantillons et diluer la solution de chargement NGF et les échantillons de solution de postchargement collectés à la plage de concentration appropriée pour le kit iliza.
Lorsque tous les échantillons ont été dilués, ajouter 100 microlitres des échantillons dilués dans des échantillons de courbe d’étalonnage à chaque puits d’une plaque d’anticorps de capture NGF enduit 96 plaques bien iliza pour une incubation de deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver la plaque quatre fois et ajouter une centaine de microlitres d’un microgramme par millilitre d’anticorps de détection biotétilisé à chaque puits pendant une incubation de deux heures à température ambiante. Après quatre lavages, comme démontré ajouter 100 microlitres d’Avidin-Horseradish Peroxidace à chaque puits pour une incubation de 30 minutes à température ambiante suivie de quatre lavages dans tampon de lavage comme démontré.
Après le dernier lavage, ajouter 100 microlitres de solution de substrat à chaque puits pour une incubation de développement des couleurs de 25 minutes à température ambiante. Utilisez ensuite un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorption à 405 nanomètres avec la correction de la longueur d’onde fixée à 650 nanomètres et déterminer la concentration de NGF à la fois dans la solution de chargement et la solution de postchargement collectée en fonction de la courbe d’étalonnage. Pour la libération in vitro de NGF, incuber les porteurs oxydés oxydés de silicium poreux de NGF dans deux millilitres de zéro point zéro un PBS molaire complété avec un albaman de sérum de boyvine de pourcentage dans zéro point zéro deux pour cent d’azide de sodium à 37 degrés Celsius et 100 rotations par minute d’adjatation orbitale.
Récupérez la solution tous les deux jours en la remplaçant par deux millilitres de PBS frais après chaque aspiration. Ensuite, congelez les échantillons de libération recueillis dans de l’azote liquide pour moins 20 degrés Celsius de stockage jusqu’à ce que l’analyse NGF par iliza comme vient de le démontrer. Pour générer un sitoma feo cromo différencié 12 ou PC 12, la culture cellulaire, recueillir la suspension cellulaire par sentripugation et suspendre à nouveau les cellules en cinq millilitres de milieu de croissance de base frais.
Après une deuxième sentribugation, suspendre à nouveau le palais en trois millilitres de milieu de croissance de base et utiliser une seringue de calibre 23 pour aspirer les cellules 10 fois pour séparer les grappes cellulaires. Après compter, graine une fois 10 à la quatrième cellules par centimètre carré zone de travail sur un type colligen une plaques enduites en présence de milieu de différenciation. Placer les assiettes dans l’incubateur.
Après 24 heures à 37 degrés Celsius ajouter frais murine bêta NGF ou NGF chargé porte-silicium poreux à chaque plaque et retourner les plaques à l’incubateur. Pour évaluer la viabilité des cellules, incuber les cultures avec 10 pour cent d’une solution d’indicateur de viabilité appropriée aux points de temps représentatifs pendant cinq heures à 37 degrés Celsius et mesurer l’absorption sur un spectropétomètre à 490 nanomètres avec la correction de la longueur d’onde fixée à 630 nanomètres. Pour évaluer la différenciation cellulaire du PC 12 en présence de porteurs de silicium poreux chargés de NGF, ensemencer les cellules PC 12 dans 12 plaques enrobées de collagène bas pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire et introduire les échantillons libérés in vitro précédemment obtenus dans les puits expérimentaux appropriés.
Après une incubation de 24 heures, imagez les cellules par microscopie légère et comptez manuellement le nombre de cellules avec des alkronurites dans chaque puits. Pour l’analyse morphrométrique des cellules PC 12 différenciées acquérir des images de phase des cellules de culture jusqu’à trois jours après le traitement avec NGF et ouvrir les fichiers dans le neurone J.Convertir le fichier d’image en un format de huit bits et utiliser la barre d’échelle d’image pour mesurer le rapport pixel/micromètre. Utilisez l’analyse et réglez l’échelle pour définir l’échelle et mesurer la longueur de chaque neurite.
Comptez ensuite manuellement le nombre de points de ramification et le nombre de nourites provenant de chaque soma cellulaire. Des images de microscopie électronique à balayage haute résolution du film de silicium poreux oxydé résultant sont montrées. Un micrographe de vue supérieure du film révèle sa nature très poreuse avec des pores d’environ 40 nanomètres de diamètre.
Un micrographe sectionnel d’un film fendi révèle une épaisseur poreuse de couche de deux micromètres de point neuf qui se caractérise par des pores cylindriques interconnectants. Une libération soutenue de NGF sans effet d’éclatement est atteinte pour une période d’un mois avec une libération plus rapide de NGF au cours de la première semaine par rapport à un taux de libération beaucoup plus lent dans les derniers jours de la période de libération. Le traitement avec des porteurs poreux de silicium chargés de NGF induit la formation des neurites dans les réseaux neuronaux ram ram ramés caractéristiques dans les cultures cellulaires pc 12.
Notez que même après 26 jours, le NGF libéré induit la différenciation cellulaire de plus de 50 pour cent indiquant que le piégeage de NGF dans l’hôte poreux préserve l’activité biologique de la protéine pendant une période d’environ un mois. L’analyse morphométrique des populations poreuses chargées de cellules traitées au silicium poreux du NGF aux jours un et trois révèle que les cellules PC 12 traitées avec du silicium poreux chargé de NGF présentent des valeurs morphométriques semblables à celles observées dans les cultures de traitement contrôlées pour les trois paramètres testés. En suivant et en accomplissant adéquatement les étapes présentées vous fournira un système avantageux de livraison de NGF capable de soutenir la survie et la différenciation des cellules neuronales.
Nous étudions actuellement l’utilisation des porteurs poreux de silicium de NGF comme implants de libération à long terme dans le cerveau pour étudier leur effet protecteur normal et connaître des maladies dégénératives telles que la maladie d’Alzheimer. Après cette procédure, l’effet des porteurs poreux de silicium chargés de NGF sur une croissance normale des cellules dosales de gangrène de bois peut également être étudié. Le silicium poreux est un nanomatériau prometteur qui peut être utilisé pour un large éventail d’applications.
Autre que celui présenté ici, y compris les capteurs biologiques ou chimiques, le diagnostic et l’imagerie. Pour exclure toute toxicité potentielle des porteurs de silicium poreux, vers votre lignée cellulaire, assurez-vous d’effectuer un essai de séverabilité et de stériliser vos échantillons de silicium poreux.
