在该协议中，我们演示了如何使用自由生活方法c. elegans 来阐明通过 Mitis Group 链球菌产生的过氧化氢引起的致病性。这项技术的主要优点是，我们可以通过使用活性氧物种的可持续生物来源而不是化学来源来研究蠕虫中的致病性和应激反应的激活。对于一升介质，在2升Erlin Myer烧瓶中加入30克的Tod Hewitt粉末、2克酵母提取物和20克的啤酒。
在烧瓶中加入970毫升的去维水，放入搅拌棒中。使用铝箔盖住开口。在121摄氏度的温度下将介质在121摄氏度的温度下，以每平方英寸15磅的压力，在30分钟内被高压。
此后，将烧瓶放在搅拌板上，轻轻搅拌冷却。在层罩下，将介质倒入大小适当的无菌培养皿中。让介质干燥 2 小时。
此后，将盘子存放在4摄氏度，长达1个月。在制备 Mitis 组链球菌之前，在培养箱中将 THY agar 板加热到 37 摄氏度。之后，使用无菌循环，以条纹出所需的菌株在地方。
然后将盘子放入蜡烛罐中，在37摄氏度下孵育约18小时，以提供一个微嗜血环境。第二天，从蜡烛罐中取下盘子，使用无菌循环来挑选孤立的菌落。接种含有2mlTHY汤的15毫升无菌锥形管。
紧固盖，在静态条件下在 37 摄氏度下孵育管。在培养箱中预热的 THY 板温度达到 37 摄氏度，在 THY 板上加入 50 微升含有 1000 个单位的催化酶溶液。使用无菌扩散器摊铺催化酶溶液，让板在层流罩上干燥 30 分钟。
要用链球菌菌株对板材进行播种，请使用移液器将80微升的隔夜生长培养物加入到板材中，并使用无菌传播器将细菌完全扩散到阿加表面。在37摄氏度的蜡烛罐中孵育盘子过夜。作为一种控制，在两个NGM板上，添加80微升的隔夜生长的大肠杆菌OP-50培养物进行播种。
在37摄氏度下孵育板过夜。第二天，从蜡烛罐中取下盘子，让盘子冷却到室温。使用无菌蠕虫采摘，将 30 L4 幼虫从 NGM 喂养板转移到链球菌种子的 THY 板。
在25摄氏度下孵育板。在解剖显微镜下，数数每个板上活体和死L4幼虫的数量，在多个时间点。使用无菌蠕虫选择轻轻地生产蠕虫，并确定它们是死是活。
最初，每 30 分钟将蠕虫评分为已死或每 30 分钟一次。当蠕虫迅速开始死亡时，每隔 15 分钟给它们一个评分。检测需要5至6个小时才能完成。
之后，再重复两次实验。要准备阿加罗斯垫，请沿着两个玻璃滑梯纵向粘上实验室。这将确定红糖垫的厚度。
在两个胶带的幻灯片之间放置一个干净的玻璃滑梯。在去维化水中溶解阿加罗斯，使2个重量体积百分比，并在微波炉中加热溶液。使用移液器将 100 微升熔融的气糖放在清洁滑轨的中心。
立即将另一个干净的玻璃滑梯放在熔融的加糖顶部，然后轻轻按下以制作垫子。让加糖凝固，然后拆下顶部滑动。加糖垫已准备就绪。
预热 THY 板至 37 摄氏度。与之前在生存测定中所做的一样，用链球菌菌株播种板。种子3NGM板与大肠杆菌OP-50作为控制和孵育在37摄氏度过夜。
第二天，将盘子冷却到室温。使用 M9W 缓冲液将 L4 幼虫从 NGM 或 NGM RNAi 喂养板中清洗到 15 ml 锥形管中。在离心机中旋转管450倍，一分钟。
去上一液，并添加10毫升M9W到每个管。再重复离心步骤三次。将蠕虫重新悬浮在 M9W 的 250 微升中，将三个 5 微升的蠕虫悬浮液滴放在干净的 Petri 盘盖上。
在解剖显微镜下，估计每微升蠕虫的数量。使用移液器，将大约 100 个 L4 幼虫添加到每个 THY 链球菌种子和 NGM 大肠杆菌种子板中。每株细菌使用三个板。
在25摄氏度下孵育板2至3小时。之后，从培养箱中取出板。用 M9W 清洗它们，并在 15ml 锥形管中收集蠕虫。
洗涤蠕虫三次，如以前在离心步骤中完成。通过吸气去除大部分 M9W。并在蠕虫颗粒中加入500微升含有2毫摩尔亚兹钠或盐酸四米素的微升，用于麻醉。
在室温下用蠕虫颗粒孵育管15分钟。然后，将蠕虫悬浮液的15微升滴到事先准备好的垫上。在荧光显微镜下，利用菲茨和达皮滤镜可视化skn-1的本地化。
图像蠕虫的放大倍数为 10 倍，放大倍数为 20 倍。根据三个本地化级别对蠕虫进行评分;低局部化，其中没有观察到核本地化，中等局部化，蠕虫前部或后部有SKN 1 BCGFP，高局部化，在所有肠道细胞中观察到skn-1 BCGFP的核本地化。在这个实验中，Mitis组的成员迅速杀死了蠕虫，而不是S.mutans，S.s.salivarius和非致病性大肠杆菌OP-50。
当猫酶被补充到YTH ager时，蠕虫的杀戮被废除。与野生型和恭维菌株相比，在三角洲spxB突变菌株上未观察到蠕虫的死亡。这些数据表明，Mitis集团产生的过氧化氢是蠕虫的中分。
与病媒对照处理的蠕虫相比，观察到skn-1击倒蠕虫的存活率显著降低。与skn-1突变菌株和N2野生型蠕虫观察到类似的杀戮表型。这表明skn-1影响蠕虫在Mitis组的生存。
skn-1 BCGFP 的局部化是在暴露在野生 N 型维高菌株中的蠕虫中观察到的，而不是对 S- 9 的 Delta spxB 突变菌株的反应。在P38图激酶通路成分被击倒后，观察到skn-1 BCGFP的局部化减少，并击倒经过处理的蠕虫，相对于病媒控制处理的蠕虫。通过使用链球菌c。
利根系统，过氧化氢对内质性垂直应力、线粒体损伤、线粒体、线磷和磷化的影响可进一步研究。此外，还可以确定过氧化氢作为病毒性因素通过破坏细胞核心过程来引起免疫反应的机制。
