难以调节人类小岛的基因表达，人类小岛功能的下降幅度也更大，在基因表达调制后也构成重大挑战。通过结合扁病毒中导SHR8转导和形成人类合适的小岛。该协议允许有效降低目标基因的调节，同时在长期培养期间保持小岛功能。
首先，轻轻旋转运输瓶，以保持小岛在悬挂。将含有小岛的运输介质转移到 50 毫升锥形离心管中。让管子在生物安全柜中坐15分钟，使小岛安顿到管子的底部。
使用毛细管移液器轻轻拆下运输介质，而不会干扰小岛颗粒。用 1% 的人血清白蛋白将 CMRL 介质中的小岛颗粒重新悬浮到每毫升 400 个小岛当量的浓度。将小岛转移到非组织培养皿中，并在 5%的二氧化碳培养箱中以 37 摄氏度进行培养。
经过通宵培养后，将人类小岛转移到15毫升锥形离心管中，在摆动的桶转子中以250倍g的离心机进行5分钟。用毛细管移液器吸气介质，而不会干扰小岛颗粒。将颗粒清洗至管中，将10毫升PBS洗净，轻轻混合，以250倍g离心5分钟。
离心后，在不干扰小岛颗粒的情况下吸入PBS。将颗粒重新悬浮在预热蛋白解和胶原蛋白酶混合物的0.5毫升中。使用 P1000 移液器混合小岛五次移液器。
在37摄氏度下孵育5分钟。孵育后，混合移液器轻轻上下抚摸。检查单细胞云量和薄片或未消化小岛的数量。
将 40 微米过滤器放在 35 毫米培养皿中，通过加入 10% 热灭活胎儿牛血清和用 1 毫升注射器柱塞压压，将一毫升 CMRL 介质加入湿化过滤器。转移所有在过滤器顶部的细胞悬浮液。并在一个新的15毫升管收集通过。
用0.5毫升的新鲜CMRL介质清洗用于小岛消化的管子，收集剩余的细胞，并通过过滤器进行洗涤。将通道组合在15毫升的管子中。重复一次。
要分离留在过滤器上的未消化小岛，请用一毫升注射器柱塞按压过滤器。再次收集通过，用新鲜的普通CMRL 1066介质清洗过滤器，从过滤器和盘子中去除所有剩余的消化小岛。将通道添加到 15 毫升管中。
记录细胞悬浮液的总体积，并服用10微升的细胞等分，以计算血细胞计的细胞数。在200倍g下将细胞悬浮液离心5分钟后，在不干扰颗粒的情况下取出介质。要使用96孔超低附着板生产伪小岛，首先计算所需总体积的1倍10至第五细胞每毫升的单细胞悬浮液。
然后，用10%的热灭活胎儿血清重新悬浮CMRL培养中的胰岛颗粒，使30微升细胞悬浮液有3000个细胞。接下来，将单细胞悬浮液所需的体积转移到新鲜 15 毫升管中。在含有SH-RNA的扁家病毒每细胞250个转导单元，目标为感兴趣的基因或控制基因。
要将细胞悬浮液与病毒混合，移液器用P1000移液器轻轻混合五次。然后，如果使用八通道移液器，将混合细胞转移到50毫升无菌试剂储液罐中。使用八通道移液器或 P200 移液器，将每井的 30 微升与扁病毒混合到每个井中。
接下来，在室温下以270倍g的270倍g将96井板离心7分钟。在37摄氏度的高温下，在一夜之间在一个加湿的5%二氧化碳孵化器中。孵育后，从培养箱中取出96井板，放在生物安全柜中。
每个小岛100微升的10%高FBSCMRL进入井，以防止小岛干燥，并继续培养一个星期。每孔CMRL介质的移液器100微升，用10%的热灭活胎儿牛血清从储液罐到伪胰岛，移液器上下两到三次轻轻地在井中抬起小岛。然后，吸气的介质在井中含有一个伪岛，并弹出到10厘米的培养皿。
在光学显微镜下检查板，以确保完全去除所有伪小岛，然后进行下游实验。要使用 24 孔微井培养板生产伪小岛，首先添加 500 微升每孔的抗粘附冲洗溶液。在摆动铲斗板离心机中以 1300 倍 g 离心，5 分钟。
然后，在显微镜下观察板，以确保从微孔中去除气泡。在生物安全柜中，从井中吸出防粘剂冲洗溶液。用两毫升暖普通CMRL 1066介质冲洗每口井一次。
然后，吸气平原CMRL 1066介质，并添加0.5毫升每井温暖的CMRL与10%的热灭活胎儿牛血清到每个精心规划使用。确定每一个井所需的细胞总数。用10%的热灭活胎儿血清在无菌的1.5毫升管中，用0.8毫升CMRL培养的单个细胞重新悬浮。
为了制造一口由扁病毒转导的伪岛井，每个细胞增加125个转导单元，使病毒的体积保持在0.2毫升以下。在37摄氏度下孵育细胞和病毒混合物，偶尔温和混合一小时，使细胞与病毒接触，然后凝结细胞。一小时后，通过添加CMRL培养器和10%热灭活胎儿牛血清，将胰岛细胞和病毒混合物的总体积调整为1毫升。
如果细胞在一小时后形成团块，通过温和和快速移液两到三次分散到单个细胞悬浮液中。将电池悬浮液转移到 24 井微井培养板的一个井中。紧接着移液，在室温下以100倍g离心3分钟，将细胞捕获到所有微孔中。
在显微镜下观察，验证细胞在所有微孔中均匀分布。将小岛单细胞悬浮液加入井中后，立即将微井板离心至关重要。在96孔超低附着板中创建的3000个人类小岛细胞的伪小岛形态的连续变化表明，单层或松散的细胞团在一周内以平滑的圆边界变成固体聚集体。
相比之下，在微井培养板中，细胞和伪小岛的形成通常仅在4天内可见。伪小岛的统一大小减少了测试组内的变异，并允许静态孵育，每个测量只使用五个伪小岛。Perry融合胰岛素反应分析显示，人类伪不对岛在培养七天后，对葡萄糖保持了强大的第一阶段胰岛素分泌。
将针对人类脂肪甘油三酯脂肪酶或五个基因的扁病毒引入单个细胞悬浮液中，确保小岛细胞高效、均匀的转导，并实现对基因的高效低调节。重要的是要记住，将人类小岛分散到单个细胞中所用的时间受许多因素的影响，如:大小、分布和供体特征。因此，在消化过程中密切注意人类小岛消失是十分重要的。
在整个协议中，轻轻处理单细胞悬浮液以避免细胞丢失非常重要。正在创建的人类伪小岛可用于许多应用，以确定基因调制的效果，如:西方的布洛特，组织学研究和氧气消耗率的测量。该协议允许使用常见的实验室软件和简单的技术，评估目标基因在调节小岛健康和人类小岛功能方面的低值。
使用人类小岛可能需要事先获得当地审查委员会的批准。在开始研究之前，请咨询当地审查委员会。伦蒂病毒被归类为生物安全二级。
在开始使用扁病毒之前，请与生物安全委员会联系。
