İnsan adacıklarında gen ekspresyonunu modüle etmek zordur, ayrıca işleyen insan adacıklarının daha fazla azalması gen ekspresyonunun modülasyonundan sonra büyük zorluklar alacaktır. Lentivirus aracılı SHR8 transdüksiyon ve insan uygun adacıkların oluşumu birleştirerek. Bu protokol, uzun süreli kültür sırasında adacık fonksiyonunu korurken hedeflenen genin etkin bir şekilde küçültünmesine olanak sağlar.
Başlamak için, yavaşça süspansiyon adacıkları tutmak için nakliye şişesi girdap. Adacıkiçeren nakliye aracını 50 mililitrelik konik santrifüj tüpe aktarın. Adacıklar tüpün dibine yerleşmek için tüp 15 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik kabininde oturalım.
Adacık peletini rahatsız etmeden kılcal pipet kullanarak nakliye ortamını hafifçe çıkarın. CMRL ortadaki adacık peletini %1 insan serum albumini ile mililitre başına 400 adacık eşdeğeri konsantrasyonuna yeniden askıya alın. Adacıkları bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede tedavi edilen bir doku dışı kültüre aktarın ve onları 37 derecede kültüre aktarın.
Bir gecede kültür sonra, bir 15 mililitrekonik santrifüj tüp içine insan adacıkları transfer, santrifüj 250 kez g beş dakika sallanan kova rotor. Ve adacık pelet rahatsız etmeden bir kılcal pipet ile orta aspire. Tüpe 10 mililitre PBS ekleyerek peleti yıkayın, yavaşça karıştırın ve 250 kez g beş dakika santrifüj.
Santrifüjden sonra, adacık peletini rahatsız etmeden PBS'yi aspire edin. Önceden ısıtılmış proteolitik ve kolajnolitik enzim karışımının 0,5 mililitrelik kısmını yeniden askıya alın. Pipet adacıkları karıştırmak için bir P1000 pipet kullanarak beş kez.
37 derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra pipetleri yavaşça yukarı ve aşağı karıştırın. Tek hücrebulanıklığı ve pul veya sindirilmemiş adacıkların sayısını kontrol edin.
35 milimetrelik petri kabına 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile bir mililitre CMRL orta ekleyerek süzgeçi ıslayın ve bir mililitreşöyiş şırınga pistonlu depresif. Tüm hücre süspansiyonuna süzgeç üstüne aktarın. Ve taze bir 15 mililitretüp içinde geçiş toplamak.
Adacık sindirimi için kullanılan tüpü, kalan hücreleri toplamak ve yıkamayı süzgeçten geçirmek için 0,5 mililitre taze CMRL ortasıyla yıkayın. 15 mililitrelik bir tüp içinde geçiş birleştirin. Bir kez tekrarlayın.
Süzgeçte kalan sindirilmemiş adacıkları ayrıştırmak için süzgeçe bir mililitrelik şırınga pistonu ile basın. Geçişi tekrar toplayın ve süzgeçten ve çanaktan kalan tüm sindirilmiş adacıkları çıkarmak için süzgecin taze düz CMRL 1066 ortamıyla yıkayın. 15 mililitrelik tüp için geçiş ekleyin.
Hücre süspansiyonunun toplam hacmini kaydedin ve hemositometredeki hücre sayısını saymak için 10 mikrolitrelik bir hücre aliquot'u alın. Hücre süspansiyonuna 200 g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, peleti bozmadan ortamı çıkarın. 96 iyi ultra düşük ek plaka kullanarak sözde adacıklar üretmek için, ilk tek hücre süspansiyon mililitre başına beşinci hücrelere gerekli bir kez 10 toplam hacmini hesaplar.
Daha sonra CMRL ortamındaki adacık peletini %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile yeniden askıya alın, böylece hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresi 3000 hücreye sahiptir. Daha sonra, tek hücreli süspansiyonun gerekli hacmini 15 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Sh-RNA içeren bir lentivirüsün hücre başına 250 transdüksiyon ünitesinde ilgi çeken bir geni veya kontrolü hedef alıyor.
Hücre süspansiyonu ile virüs karıştırılması için, pipet hafifçe bir P1000 pipet ile beş kez. Daha sonra karışık hücreleri 8 kanallı pipet kullanıyorsanız 50 mililitrelik steril reaktif haznesine aktarın. Sekiz kanallı pipet veya P200 pipet ile, her kuyuya lentivirus ile karıştırılmış hücre süspansiyonunun kuyubaşına 30 mikrolitre dağıtın.
Sonra, 7 dakika boyunca oda sıcaklığında 270 kez g bir sallanan kova plaka santrifüj 96 iyi plaka santrifüj. Bir gecede nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatöründe 37 derecede kültür. Kuluçkadan sonra, 96 kuyu plakasını kuvözden çıkarın ve biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin.
Pipet 100 mikrolitre adacık başına 100 mikrolitre% 10 yüksek FBSCMRL bir kuyuiçine adacıkların kurumasını önlemek ve bir hafta boyunca kültür devam. Pipet 100 mikrolitre CMRL orta kuyubaşına% 10 ısı rezervuar gelen fetal sığır serumu ile sözde adacıklar ve pipet yukarı ve aşağı iki veya üç kat yavaşça kuyuda adacıkları kaldırmak için. Daha sonra, bir sözde adacık içeren kuyuda orta aspire ve 10 santimetre petri kabına fırlatmak.
Tüm sözde adacıkların tamamen kaldırılmasını sağlamak için plakayı ışık mikroskobu altında kontrol edin ve alt akış deneylerine devam edin. 24 kuyu mikro kuyu kültür plakası kullanarak sözde adacıklar üretmek için, öncelikle bir anti-yapışma durulama çözeltisi kuyu başına 500 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 1300 kez g beş dakika bir sallanan kova plaka santrifüj.
Daha sonra, hava kabarcıklarının mikro-kuyulardan çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin. Biyolojik bir güvenlik kabininde, kuyulardan yapışma önleyici durulama çözeltisini aspire edin. Her birini iki mililitre ılık düz CMRL 1066 orta ile bir kez iyice durula.
Daha sonra, düz CMRL 1066 orta aspire ve her iyi kullanım için planlanan her% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile sıcak CMRL kuyu başına 0,5 mililitre ekleyin. Her kuyu için gereken toplam hücre sayısını belirleyin. 0.8 mililitre CMRL ortadaki tek hücreleri steril 1,5 mililitrelik bir tüpte %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile yeniden askıya alın.
Bir lentivirüs tarafından transe kantinde sahte adacık bir kuyu oluşturmak için, 0.2 mililitre altında virüs hacmini tutarak tek hücre süspansiyon hücre başına 125 transdüksiyon birimleri ekleyin. Hücrelerin yoğuşma önce virüs ile hücrelerin temas sağlamak için bir saat boyunca ara sıra nazik karıştırma ile 37 santigrat derece hücre ve virüs karışımı kuluçka. Bir saat sonra, %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile CMRL orta ekleyerek adacık hücresi ve virüs karışımının toplam hacmini bir mililitreye ayarlayın.
Eğer hücreler bir saatlik kuluçkadan sonra kümeler oluşursa, nazik ve hızlı bir şekilde 2-3 kez borulama ile tek bir hücre süspansiyonuna dağılırlar. Hücre süspansiyonuna 24 kuyudaki mikro-kuyu kültür plakasının bir kuyusu aktarın. Pipetlemenin hemen ardından, hücreleri tüm mikro kuyulara yakalamak için oda sıcaklığında 100 kez g.'de üç dakika santrifüj yapın.
Hücrelerin tüm mikro kuyularda eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. Kuyuyu kuyuya tek hücreli süspansiyonu kuyuya ekledikten hemen sonra mikro kuyu plakasını santrifüj etmek çok önemlidir. 96 iyi ultra düşük eki plaka oluşturulan 3000 insan adacık hücrelerinden pseudo-adacıkların morfolojisi sıralı değişiklikler tek katmanlı veya hücrelerin gevşek kümeleri bir hafta içinde pürüzsüz bir yuvarlak sınır ile katı agregalar dönüştü gösterdi.
Buna karşılık, bir mikro-iyi kültür plaka, hücre ve pseudo-adacıklar sadece 500 adacık hücrelerinden oluşumu genellikle dört gün içinde görülebilir. Sözde adacıkların tek düze boyutu, bir test grubu içindeki değişimi azaltır ve ölçüm başına beş adet sahte adacık kullanarak statik kuluçkaya izin verir. Perry Fusion Assay insülin yanıtı için insan sözde adacıklar kültür yedi gün sonra glikoz yanıt olarak sağlam ilk faz insülin salgısını muhafaza gösterdi.
İnsan yağtrigliserid lipaz veya perilipin beş geni tek hücreli süspansiyona hedefleyen lentivirüsün tek hücreli süspansiyona girmesi, adacık hücrelerinin verimli ve homojen transdüksiyonuna izin verir ve genlerin yüksek verimli bir şekilde aşağılanmasına neden olur. İnsan adacıklarını tek hücrelere dağıtmak için gereken sürenin boyut, dağılım ve donör karakteristiği gibi birçok faktörden etkilendiğini unutmamak gerekir. Bu nedenle, sindirim sırasında insan adacıklarının kaybolmasına çok dikkat etmek önemlidir.
Protokol boyunca hücre kaybını önlemek için tek hücreli süspansiyonu nazikçe işlemek önemlidir. Oluşturulan insan sözde adacıkları gibi gen modülasyonu etkisini belirlemek için birçok uygulama için kullanılabilir: Batı Leke, histolojik çalışma ve oksijen tüketim oranlarının ölçümleri. Bu protokol, ortak laboratuvar gereçleri ve basit teknikler kullanarak adacık sağlığının düzenlenmesinde hedeflenen genin düşükünün ve insan adacıklarının işlevinin değerlendirilmesini sağlar.
İnsan adacıklarının kullanımı için yerel bir inceleme kurulunun onayı gerekebilir. Lütfen çalışmanın başlamasından önce yerel inceleme kuruluna danışın. Lentivirus biyogüvenlik seviyesi 2 olarak sınıflandırılır.
Lentivirüsün kullanımına başlamadan önce biyogüvenlik komitesine başvurun.
