من الصعب تعديل التعبير الجيني في الجزر البشرية ، كما أن الانخفاض الأكبر في الجزر البشرية العاملة يشكل تحديات كبيرة بعد تعديل التعبير الجيني. عن طريق الجمع بين فيروس العدس بوساطة SHR8 transduction وتشكيل الجزر البشرية المناسبة. يسمح هذا البروتوكول بالتراجع الفعال للجين المستهدف مع الحفاظ على وظيفة الجزيرة أثناء الاستزراع المطول.
للبدء، دوامة بلطف زجاجة الشحن للحفاظ على الجزر في التعليق. نقل وسيطة الشحن التي تحتوي على الجزر الصغيرة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر. دع الأنبوب يجلس في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 15 دقيقة حتى تستقر الجزر الصغيرة في قاع الأنبوب.
إزالة المتوسطة الشحن بلطف باستخدام ماصة شعرية دون إزعاج بيليه جزيرة. إعادة تعليق بيليه جزيرة في المتوسط CMRL مع 1٪ البوم مصل الإنسان إلى تركيز 400 ما يعادل الجزيرة لكل ملليلتر. نقل الجزر إلى ثقافة غير الأنسجة معالجة طبق وثقافتها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ بين عشية وضحاها.
بعد الاستزراع بين عشية وضحاها، نقل الجزر البشرية إلى أنبوب مركزي مخروطي 15 ملليلتر، طرد مركزي بمعدل 250 ضعف غرام لمدة خمس دقائق في دوار دلو متأرجح. ويُفطّن الوسيط بمُصَحٍ شعري دون إزعاج بيليه الجزيرة. غسل بيليه بلدي إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب، مزيج بلطف والطرد المركزي في 250 مرات ز لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، التعرق PBS دون إزعاج بيليه جزيرة. إعادة تعليق بيليه في 0.5 ملليلتر من مزيج الإنزيمات البروتيوليكية وكولاجينية الكولاجينية قبل الدفء. الماصات خمس مرات باستخدام ماصة P1000 لخلط الجزر.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مزيج ماصة مداعبة صعودا وهبوطا بلطف. تحقق من الغيوم الخلية واحدة وعدد من رقائق أو الجزر غير مهضومة.
وضع مصفاة 40 ميكرون في طبق بتري 35 ملليمتر والرطب مصفاة بإضافة ملليلتر واحد من المتوسط CMRL مع 10٪ تنشيط مصل البقر الجنينية والاكتئاب مع مضخم حقنة ملليلتر واحد. نقل جميع تعليق الخلية على رأس مصفاة. وجمع تمرير من خلال في أنبوب 15 ملليلتر الطازجة.
غسل أنبوب المستخدمة في الهضم جزيرة مع 0.5 ملليلتر من المتوسط CMRL الطازجة لجمع بقايا الخلايا وتمرير غسل من خلال مصفاة. الجمع بين تمرير من خلال في أنبوب 15 ملليلتر. كرر مرة واحدة.
لتفكك الجزر غير مهضومة المتبقية على مصفاة، اضغط على مصفاة مع المكبس حقنة ملليلتر واحد. جمع تمريرة من خلال مرة أخرى وغسل المصفاة مع CMRL 1066 المتوسطة العادية الطازجة لإزالة جميع الجزر المهضوجمة المتبقية من المصفاة والطبق. إضافة تمرير من خلال إلى أنبوب 15 ملليلتر.
سجل الحجم الإجمالي للتعليق الخلية واتخاذ 10 ميكرولتر aliquot من الخلايا لحساب عدد الخلية على مقياس الهيموسيت. بعد الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز، وإزالة المتوسطة دون إزعاج بيليه. لإنتاج شبه الجزر باستخدام 96 جيدا لوحة مرفق منخفضة جدا، أولا حساب الحجم الإجمالي المطلوبة مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تعليق خلية واحدة.
ثم, إعادة تعليق بيليه جزيرة في المتوسط CMRL مع 10٪ حرارة تنشيط مصل البقر الجنينية بحيث 30 ميكرولترات من تعليق الخلية لديه 3000 الخلايا. بعد ذلك، نقل الحجم المطلوب من تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 ملليلتر جديد. في 250 وحدة نقل لكل خلية من فيروس العدس التي تحتوي على SH-RNA استهداف جين من الاهتمام أو السيطرة.
لخلط تعليق الخلية مع الفيروس، ماصة بلطف خمس مرات مع ماصة P1000. ثم نقل الخلايا المختلطة إلى خزان كاشف معقم 50 ملليلتر إذا باستخدام ماصة قناة ثمانية. مع ماص قناة ثمانية أو ماص P200، الاستغناء 30 ميكرولترس في بئر من تعليق الخلية مختلطة مع فيروس العدس في كل بئر.
بعد ذلك، الطرد المركزي لوحة البئر 96 في جهاز طرد مركزي صفيحة دلو يتأرجح في 270 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. ثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطبة بين عشية وضحاها. بعد الحضانة، وإزالة لوحة 96 جيدا من الحاضنة ووضعها في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
Pipette 100 ميكرولترز لكل جزيرة من 10٪ FBSCMRL عالية في بئر لمنع تجفيف الجزر ومواصلة الثقافة لمدة أسبوع واحد. Pipette 100 ميكرولترات لكل بئر من المتوسط CMRL مع 10٪ حرارة تنشيط مصل البقر الجنين من الخزان إلى الجزر الزائفة والماصات صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات بلطف في البئر لرفع الجزر حتى. ثم، التعرق المتوسطة في البئر التي تحتوي على جزيرة زائفة وإخراجها في طبق بتري 10 سنتيمترا.
تحقق من اللوحة تحت مجهر خفيف لضمان الإزالة الكاملة لجميع الجزر الزائفة والمضي قدما في تجارب المصب. لإنتاج شبه الجزر باستخدام 24 جيدا جدا لوحة ثقافة الآبار الصغيرة، أولا إضافة 500 ميكرولترات في بئر من حل مكافحة الامتثال الشطف. أجهزة الطرد المركزي في 1300 مرة ز لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي لوحة دلو يتأرجح.
ثم، مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان إزالة فقاعات الهواء من الآبار الصغيرة. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، الطامح حل الشطف المضادة للانضمام من الآبار. شطف كل بئر مع ملليلتر اثنين من دافئ CMRL عادي 1066 المتوسطة مرة واحدة.
ثم, التعرق في CMRL عادي 1066 المتوسطة وإضافة 0.5 ملليلتر في بئر من CMRL الحارة مع 10٪ حرارة تنشيط مصل الأبقار الجنينية إلى كل مخطط جيدا للاستخدام. تحديد العدد الإجمالي للخلايا اللازمة لكل بئر. إعادة تعليق الخلايا المفردة في 0.8 ملليلتر من متوسط CMRL مع 10٪ من الحرارة تنشيط مصل الأبقار الجنين في أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة.
لإنشاء بئر واحد من الجزر الزائفة التي يتم تحويلها بواسطة فيروس العدس، أضف 125 وحدة تحويل لكل خلية إلى تعليق الخلية المفردة مع الحفاظ على حجم الفيروس دون 0.2 ملليلتر. احتضان الخلية وخليط الفيروس في 37 درجة مئوية مع خلط لطيف في بعض الأحيان لمدة ساعة واحدة للسماح للاتصال من الخلايا مع الفيروس قبل تكثيف الخلايا. بعد ساعة واحدة، ضبط الحجم الإجمالي لخلية جزيرة وخليط فيروس إلى ملليلتر واحد عن طريق إضافة متوسط CMRL مع 10٪ من الحرارة تنشيط مصل البقرة الجنينية.
إذا كانت الخلايا تشكل كتل بعد حضانة ساعة واحدة تفريق في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف وسريع مرتين إلى ثلاث مرات. نقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من 24 جيدا لوحة ثقافة صغيرة جيدا. مباشرة بعد الأنابيب، الطرد المركزي في 100 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق لالتقاط الخلايا في جميع الآبار الدقيقة.
مراقبة تحت المجهر للتحقق من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في جميع الآبار الدقيقة. من المهم للغاية أن يتم طرد لوحة الدقيق في البئر مباشرة بعد إضافة البئر الذي يخلط تعليق الخلية المفردة في الآبار. وأظهرت التغيرات المتتالية في مورفولوجيا الجزر الزائفة من 3000 خلية جزرية بشرية تم إنشاؤها في لوحة مرفق منخفضة للغاية 96 طبقة أحادية أو فضفاضة من الخلايا تحولت إلى مجاميع صلبة مع حدود دائرية ناعمة في أسبوع واحد.
في المقابل، في لوحة ثقافة الآبار الدقيقة، عادة ما يكون تشكيل الخلايا والجزر شبهية من 500 خلية جزيرة مرئية في غضون أربعة أيام. والحجم الموحد لليجريات الزائفة يقلل من الاختلاف داخل مجموعة الاختبار ويسمح باحتضان ساكن باستخدام أقل من خمس جزر شبهية لكل قياس. وأظهرت اختبار بيري فيوجن لاستجابة الأنسولين الجزر الزائفة البشرية الحفاظ على إفراز الأنسولين المرحلة الأولى قوية ردا على الجلوكوز بعد سبعة أيام من الثقافة.
إدخال فيروس العدس التي تستهدف الدهون الدهنية ليبوزيل أو perilipin خمسة الجينات في تعليق خلية واحدة يضمن نقل كفاءة ومتجانسة من خلايا الجزيرة ويحقق كفاءة عالية downregulation الجينات. من المهم أن نتذكر أن الوقت اللازم لتفريق جزيرة الإنسان في خلايا مفردة يتأثر بالعديد من العوامل مثل: الحجم والتوزيع والسمة المانحة. لذلك ، من المهم إيلاء اهتمام وثيق لاختفاء الجزر البشرية أثناء الهضم.
في جميع أنحاء البروتوكول من المهم التعامل مع تعليق خلية واحدة بلطف لتجنب فقدان الخلية. يمكن استخدام الجزر الزائفة البشرية التي يتم إنشاؤها للعديد من التطبيقات لتحديد تأثير تعديل الجينات مثل: لطخة غربية ودراسة النسيج وقياسات معدلات استهلاك الأكسجين. يسمح هذا البروتوكول بتقييم انخفاض الجينات المستهدفة في تنظيم صحة الجزيرت والوظائف في الجزر البشرية باستخدام الب اواع المختبرات الشائعة والتقنيات البسيطة.
وقد يتطلب استخدام الجزر الصغيرة البشرية موافقة مسبقة من مجلس استعراض محلي. يرجى استشارة مجلس المراجعة المحلي قبل بدء الدراسة. ويصنف فيروس العدتين على أنه مستوى السلامة البيولوجية الثاني.
اتصل بلجنة السلامة البيولوجية قبل البدء في استخدام فيروس العدس.
