É difícil modular a expressão genética nas ilhotas humanas, também maior declínio das ilhotas humanas em funcionamento representam grandes desafios após a modulação da expressão genética. Combinando a transdução SHR8 mediada pelo lentivírus e a formação de ilhotas humanas adequadas. Este protocolo permite uma regulação eficiente de um gene direcionado, preservando a função de ilhota durante a cultura prolongada.
Para começar, gire suavemente a garrafa de transporte para manter as ilhotas em suspensão. Transfira o meio de transporte contendo ilhotas para um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Deixe o tubo sentar em um armário de segurança biológica por 15 minutos para que as ilhotas se acomodem no fundo do tubo.
Remova o meio de transporte suavemente usando uma pipeta capilar sem perturbar a pelota de ilhota. Suspenda a pelota de ilhota no meio CMRL com albumina de soro humano de 1%para uma concentração equivalente a 400 ilhotas por mililitro. Transfira ilhotas para um prato tratado sem cultura de tecido e cultue-as a 37 graus celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite.
Após a cultura da noite para o dia, transfira ilhotas humanas para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros, centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em um rotor de balde balançando. E aspirar o meio com uma pipeta capilar sem perturbar a pelota de ilhota. Lave a pelota adicionando 10 mililitros de PBS ao tubo, misture suavemente e centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos.
Após centrifugação, aspirar PBS sem perturbar a pelota de ilhota. Suspenda a pelota em 0,5 mililitros de uma mistura de enzimas proteolíticas e colagens pré-aquecidas. Pipeta cinco vezes usando uma pipeta P1000 para misturar ilhotas.
Incubar a 37 graus celsius por cinco minutos. Após a incubação, misture a pipeta acariciando para cima e para baixo suavemente. Verifique se há nebulosidade celular única e o número de flocos ou ilhotas não digeridas.
Coloque um coador de 40 mícrons em uma placa de petri de 35 milímetros e molhe o coador adicionando um mililitro de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor e deprimente com um êmbolo de seringa de um mililitro. Transfira toda a suspensão do celular em cima do filtro. E recolher a passagem em um tubo fresco de 15 mililitros.
Lave o tubo usado para digestão de ilhotas com 0,5 mililitros de meio CMRL fresco para coletar as células restantes e passar a lavagem através do coador. Combine a passagem em um tubo de 15 mililitros. Repita uma vez.
Para dissociar ilhotas não digeridas remanescentes no coador, pressione o coador com um êmbolo de seringa de um mililitro. Colete a passagem novamente e lave o coador com o meio CMRL 1066 fresco para remover todas as ilhotas digeridas restantes do coador e do prato. Adicione a passagem ao tubo de 15 mililitros.
Regissuor o volume total da suspensão celular e tome uma alíquota de 10 microliter de células para contar o número do celular em um hemótmetro. Depois de centrifugar a suspensão da célula por cinco minutos a 200 vezes g, remova o meio sem perturbar a pelota. Para produzir pseudo-ilhotas usando uma placa de fixação ultra baixa de 96, calcule primeiro o volume total das 10 vezes necessárias para a quinta célula por mililitro da suspensão celular única.
Em seguida, suspenda novamente a pelota de ilhota no meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor para que 30 microlitres da suspensão celular tenha 3000 células. Em seguida, transfira o volume necessário da suspensão celular única para um tubo fresco de 15 mililitros. Em 250 unidades de transdução por célula de um lentivírus contendo SH-RNA visando um gene de interesse ou um controle.
Para misturar a suspensão celular com o vírus, pipeta suavemente cinco vezes com uma pipeta P1000. Em seguida, transfira as células mistas para um reservatório de reagente estéril de 50 mililitros se usar uma pipeta de oito canais. Com uma pipeta de oito canais ou uma pipeta P200, dispense 30 microliters por poço da suspensão celular misturada com lentivírus em cada poço.
Em seguida, centrifufique a placa de 96 poços em uma centrífuga de placa de balde balançando a 270 vezes g em temperatura ambiente por sete minutos. Cultura a 37 graus celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono durante a noite. Após a incubação, retire a placa 96 da incubadora e coloque-a no armário de segurança biológica.
Pipeta 100 microliters por ilhota de 10% de altura FBSCMRL em um poço para evitar a secagem de ilhotas e continuar a cultura por uma semana. Pipeta 100 microliters por poço de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% do reservatório para as pseudo-ilhotas e pipeta para cima e para baixo duas a três vezes suavemente no poço para levantar ilhotas para cima. Em seguida, aspire o meio no poço contendo uma pseudo-ilhota e ejete em uma placa de petri de 10 centímetros.
Verifique a placa sob um microscópio leve para garantir a remoção completa de todas as pseudo-ilhotas e proceda a experimentos a jusante. Para produzir pseudo-ilhotas usando uma placa de cultura de 24 poços, adicione primeiro 500 microliters por poço de uma solução anti-adesão. Centrifugar a 1300 vezes g por cinco minutos em uma centrífuga de placa de balde balançando.
Em seguida, observe a placa sob um microscópio para garantir que as bolhas de ar sejam removidas dos micro-poços. Em um gabinete de segurança biológica, aspire a solução anti-adesão dos poços. Enxágüe cada poço com dois mililitros de médio CMRL 1066 de planície quente uma vez.
Em seguida, aspire o médio CMRL 1066 simples e adicione 0,5 mililitro por poço de CMRL quente com soro bovino fetal inativado de 10%a calor a cada bem planejado para uso. Determine o número total de células necessárias para cada poço. Suspenda as células únicas em 0,8 mililitros de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor em um tubo estéril de 1,5 mililitro.
Para criar um poço de pseudo-ilhota transduzida por um lentivírus, adicione 125 unidades de transdução por célula à suspensão de célula única mantendo o volume de vírus abaixo de 0,2 mililitros. Incubar a mistura de células e vírus a 37 graus celsius com mistura suave ocasional por uma hora para permitir o contato das células com o vírus antes da condensação das células. Após uma hora, ajuste o volume total da mistura de células ilhotas e vírus para um mililitro adicionando meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor.
Se as células formarem aglomerados após uma hora de incubação dispersar-se em uma única suspensão celular por tubulação suave e rápida de duas a três vezes. Transfira a suspensão celular para um poço da placa de cultura de 24 poços. Imediatamente após a pipetação, centrífuga a 100 vezes g à temperatura ambiente por três minutos para capturar células em todos os micro-poços.
Observe sob um microscópio para verificar se as células estão distribuídas uniformemente em todos os micro-poços. É fundamental centrifugar a placa do micro-poço imediatamente após adicionar o poço misturando a suspensão de célula única ilhota nos poços. Mudanças sequenciais na morfologia de pseudo-ilhotas de 3000 células ilhotas humanas criadas em uma placa de 96 bem ultra baixa de fixação mostraram monocamadas ou aglomerados soltos de células transformadas em agregados sólidos com uma borda redonda suave em uma semana.
Em contraste, em uma placa de cultura de micro-poços, a formação de células e pseudo-ilhotas de apenas 500 células ilhotas é geralmente visível dentro de quatro dias. O tamanho uniforme das pseudo-ilhotas reduz a variação dentro de um grupo de teste e permite a incubação estática usando apenas cinco pseudo-ilhotas por medição. O Perry Fusion Assay para resposta à insulina mostrou que as pseudo-ilhotas humanas mantiveram uma secreção robusta de insulina em primeira fase em resposta à glicose após sete dias de cultura.
A introdução do lentivírus direcionado à lipase de trigliceride de adiposa humana ou perilipin cinco genes em uma única suspensão celular garante a transdução eficiente e homogênea das células ilhotas e alcança uma baixa altamente eficiente da regulação dos genes. É importante lembrar que o tempo necessário para dispersar a ilhota humana em células únicas é afetado por muitos fatores como:tamanho, distribuição e a característica do doador. Por isso, é importante prestar muita atenção ao desaparecimento das ilhotas humanas durante a digestão.
Durante todo o protocolo é importante lidar suavemente com a suspensão de células únicas para evitar a perda de células. As pseudo-ilhotas humanas que estão sendo criadas podem ser usadas para muitas aplicações para determinar o efeito da modulação genética, como:Western Blot, estudo histológico e as medições das taxas de consumo de oxigênio. Este protocolo permite avaliar o baixo gene direcionado na regulação da saúde das ilhotas e a função em ilhotas humanas usando material labiais comum e técnicas simples.
O uso de ilhotas humanas pode exigir uma aprovação prévia de um conselho de revisão local. Consulte o cet previamente à contratação do financiamento. O lentivírus é classificado como biossegurança nível dois.
Entre em contato com o comitê de biossegurança antes do início do uso do lentivírus.
