קשה לווסת את ביטוי הגנים באזורים אנושיים, גם ירידה גדולה יותר של איונים אנושיים מתפקדים מציבים אתגרים גדולים לאחר אפנון ביטוי הגנים. על ידי שילוב של טרנסדוקציה SHR8 מתווך SHR8 היווצרות של איונים מתאימים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר רגולציה יעילה של גן ממוקד תוך שמירה על תפקוד איון במהלך תרבות ממושכת.
כדי להתחיל, בעדינות מערבולת בקבוק המשלוח כדי לשמור על איונים בהשעיה. העבר את מדיום המשלוח המכיל איונים לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. תן לצינור לשבת בארון בטיחות ביולוגי במשך 15 דקות, כך איים להתיישב לתחתית הצינור.
הסר את מדיום המשלוח בעדינות באמצעות פיפטה נימי מבלי להפריע גלולת איון. להשעות מחדש את גלולת איון במדיום CMRL עם אלבומין סרום אנושי 1% לריכוז של 400 איון שווה ערך למיליליטר. מעבירים איונים לתבשיל שאינו רקמה ומתייחסים אליהם בתרבות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני בן לילה.
לאחר תרבות הלילה, להעביר איונים אנושיים לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך חמש דקות רוטור דלי מתנדנד. ושואפים את המדיום עם פיפטה נימית מבלי להפריע לכדור איון. לשטוף את גלולה שלי הוספת 10 מיליליטר של PBS לצינור, לערבב בעדינות צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, שאף PBS מבלי להפריע גלולת איון. להשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של תערובת אנזימים פרוטאוליטית וקולגנוליטית מחומם מראש. פיפטה חמש פעמים באמצעות פיפטה P1000 לערבב איונים.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מערבבים את הפיפטה מלטפת מעלה ומטה בעדינות. בדוק אם יש עננות של תא יחיד ומספר הפתיתים או איונים לא מעוכלים.
מניחים מסננת 40 מיקרון בצלחת פטרי 35 מילימטר והרטיבו את מסננת על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום CMRL עם 10% חום סרום חזיר עוברי מושבת ומדכא עם בוכנה מזרק מיליליטר אחד. להעביר את כל ההשעיה התא על גבי מסננת. ולאסוף את המעבר דרך בצינור טרי 15 מיליליטר.
לשטוף את הצינור המשמש לעיכול איון עם 0.5 מיליליטר של מדיום CMRL טרי כדי לאסוף שאריות תאים ולהעביר את לשטוף דרך מסננת. לשלב את המעבר בצינור 15 מיליליטר. חזור פעם אחת.
כדי לנטרל איונים לא מעוכלים שנותרו על מסננת, לחץ על מסננת עם בוכנה מזרק מיליליטר אחד. לאסוף את המעבר שוב לשטוף את מסננת עם טרי רגיל CMRL 1066 בינוני כדי להסיר את כל איונים מתעכלים הנותרים מן מסננת ואת המנה. מוסיפים את המעבר לצינור 15 מיליליטר.
הקלט את הנפח הכולל של ההשעיה התא ולקחת aliquot 10 microliter של תאים לספור את מספר התא על המוציטמטר. לאחר צנטריפוגה ההשעיה התא במשך חמש דקות ב 200 פעמים g, להסיר את המדיום מבלי להפריע את גלולה. כדי לייצר פסאודו-איונים באמצעות לוחית התקשרות נמוכה במיוחד של 96 בארות, חשב תחילה את הנפח הכולל של הדרוש פעם אחת 10 לתאים החמישיים למיליליטר של ההשעיה של תא יחיד.
לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת איון במדיום CMRL עם 10% חום בלתי מואט סרום חזיר העוברי, כך 30 microliters של ההשעיה התא יש 3000 תאים. לאחר מכן, להעביר את הנפח הנדרש של ההשעיה תא יחיד לצינור טרי 15 מיליליטר. ב 250 יחידות התמרה לכל תא של lentivirus המכיל SH-RNA מיקוד גן של עניין או שליטה.
כדי לערבב את ההשעיה התא עם הנגיף, פיפטה בעדינות חמש פעמים עם פיפטה P1000. לאחר מכן להעביר את התאים המעורבים לתוך מאגר 50 מיליליטר סטרילי ריג'נט אם באמצעות פיפטה שמונה ערוצים. עם פיפטה שמונה ערוצים או פיפטה P200, לוותר על 30 microliters ל הבאר של ההשעיה התא מעורבב עם lentivirus לתוך כל באר.
לאחר מכן, צנטריפוגה צלחת 96 גם בצנטריפוגה צלחת דלי מתנדנד ב 270 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 5%פחמן דו חמצני בן לילה. לאחר הדגירה, מוציאים את צלחת ה-96 היטב מהחמה ומ מניחים אותה בארון הבטיחות הביולוגי.
פיפטה 100 מיקרוליטר לכל אי של 10% גבוה FBSCMRL לתוך באר כדי למנוע ייבוש של איונים ולהמשיך תרבות במשך שבוע אחד. פיפטה 100 מיקרוליטרים לבא של מדיום CMRL עם 10% חום סרום חזיר עוברי מושבת מהמאגר לפסאודו-איונים ופיפט למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים בעדינות באר כדי להרים איונים למעלה. לאחר מכן, שאף את המדיום היטב המכיל פסאודו-איון ופלט לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ.
בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח הסרה מלאה של כל פסאודו איונים ולהמשיך לניסויים במורד הזרם. כדי לייצר פסאודו-איונים באמצעות צלחת תרבות מיקרו באר 24 באר, תחילה להוסיף 500 microliters לבא של פתרון שטיפה נגד דבקות. צנטריפוגה ב 1300 פעמים g במשך חמש דקות בצנטריפוגה צלחת דלי מתנדנד.
לאחר מכן, להתבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי בועות אוויר מוסרים מיקרו בארות. בארון בטיחות ביולוגי, שאפו את פתרון שטיפה נגד דבקות מה בארות. יש לשטוף כל באר עם שני מיליליטר של CMRL רגיל וחם 1066 בינוני פעם אחת.
לאחר מכן, שאפו את המדיום CMRL 1066 הפשוט והוסיפו 0.5 מיליליטר ל-CMRL חם עם 10% חום מושבת בסרום חזיר עוברי לכל אחד מתוכנן היטב לשימוש. קבע את המספר הכולל של התאים הדרושים עבור כל באר. להשעות מחדש את התאים הבודדים ב 0.8 מיליליטר של מדיום CMRL עם 10% חום מושבת סרום חזיר עוברי בצינור סטרילי 1.5 מיליליטר.
כדי ליצור באר אחת של פסאודו-איון שהותמר על ידי lentivirus, להוסיף 125 יחידות שכפול לכל תא מתלים תא יחיד שמירה על נפח הנגיף מתחת 0.2 מיליליטר. הדגירה את תערובת התאים והווירוסים ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מדי פעם במשך שעה אחת כדי לאפשר מגע של תאים עם וירוס לפני עיבוי של תאים. לאחר שעה אחת, להתאים את הנפח הכולל של תא איון ותערובת וירוסים למיליליטר אחד על ידי הוספת מדיום CMRL עם 10%חום מושבת סרום חזיר עוברי.
אם תאים יוצרים גושים לאחר דגירה של שעה אחת מתפזרים לתוך מתלה תא יחיד על ידי צינורות עדינים ומהירים פעמיים עד שלוש פעמים. העבר את ההשעיה התא ל הבאר אחת של 24 גם צלחת תרבות מיקרו היטב. מיד לאחר צינורות, צנטריפוגה ב 100 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות כדי ללכוד תאים לתוך כל מיקרו בארות.
שימו לב תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים מופצים באופן שווה בכל המיקרו-בארות. זה קריטי כדי צנטריפוגה צלחת מיקרו באר מיד לאחר הוספת גם ערבוב המתלה תא יחיד איון לתוך הבאר. שינויים רציפים במורפולוגיה של פסאודו-איונים מ-3,000 תאי איון אנושיים שנוצרו בצלחת התקשרות נמוכה במיוחד של 96 באר הראו גושים מונוליים או רופפים של תאים שהפכו לאגרגטים מוצקים עם גבול עגול חלק בשבוע אחד.
לעומת זאת, בצלחת תרבות מיקרו-באר, היווצרות תאים ופסאודו-איונים מ-500 תאי איון בלבד נראית בדרך כלל בתוך ארבעה ימים. הגודל האחיד של פסאודו-איונים מקטין את השונות בתוך קבוצת בדיקה ומאפשר דגירה סטטית תוך שימוש בחמישה פסאודו-איונים לכל מדידה. פרי פיוז'ן Assay לתגובת אינסולין הראה פסאודו-איונים אנושיים שמרו על הפרשת אינסולין חזקה בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לאחר שבעה ימים של תרבות.
כניסתה של lentivirus מיקוד שומן אנושי טריגליצרידים ליפאז או perilipin חמישה גנים לתוך השעיה תא יחיד מבטיח טרנסדוקציה יעילה הומוגנית של תאי איון ומשיגה ירידה יעילה מאוד של גנים. חשוב לזכור כי הזמן הנדרש לפיזור איון אנושי לתאים בודדים מושפע מגורמים רבים כגון: גודל, הפצה ומאפיין התורם. לכן, חשוב לשים לב להיעלמותם של איונים אנושיים במהלך העיכול.
לאורך כל הפרוטוקול חשוב לטפל בהשעיית תא יחיד בעדינות כדי למנוע אובדן תאים. פסאודו-איונים אנושיים שנוצרו יכול לשמש עבור יישומים רבים כדי לקבוע את ההשפעה של אפנון גנים כגון: כתם מערבי, מחקר היסטולוגי ואת המדידות של שיעורי צריכת חמצן. פרוטוקול זה מאפשר להעריך את הנמוך של הגן הממוקד בוויסות בריאות איון ואת הפונקציה של איונים אנושיים באמצעות כלי מעבדה נפוצים וטכניקות פשוטות.
השימוש באיים אנושיים עשוי לדרוש אישור מוקדם של ועדת בדיקה מקומית. אנא התייעצו עם ועדת הביקורת המקומית לפני תחילת המחקר. Lentivirus מסווג כרמה ביו-בטיחותית 2.
צור קשר עם ועדת בטיחות ביולוגית לפני תחילת השימוש של lentivirus.
