인간 섬에 있는 유전자 발현을 조절하는 것은 어렵고, 또한 기능하는 인간 섬의 더 중대한 쇠퇴는 유전자 발현의 변조 후에 중요한 도전을 제기합니다. 렌즈피바이러스를 결합하여 SHR8 트랜스듀션 및 인간 적합한 섬형성을 결합하였다. 이 프로토콜은 장기간 배양 중에 아일렛 기능을 보존하면서 표적 유전자의 효율적인 다운 레그규제를 허용합니다.
시작하려면, 부드럽게 현탁액에 섬을 유지하기 위해 배송 병을 소용돌이. 섬이 함유된 배송 배지를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 튜브가 15분 동안 생물학적 안전 캐비닛에 앉아 섬이 튜브 바닥에 정착하도록 하십시오.
모세관 파이펫을 사용하여 모세관 파이펫을 사용하여 선적 매체를 부드럽게 제거하십시오. CMRL 배지에서 1%의 인간 혈청 알부민으로, 밀리리터당 400개의 이슬레를 다시 중단한다. 섬들을 비조직 배양으로 옮기고 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양한다.
하룻밤 문화 후, 인간 섬을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 스윙 버킷 로터에서 5분 동안 250배 g로 옮긴다. 그리고 섬 펠릿을 방해하지 않고 모세관 파이펫으로 매체를 흡인한다. 펠릿을 튜브에 10 밀리리터를 추가하여 부드럽게 섞고 원심분리기를 250배 g에서 5분간 섞습니다.
원심 분리 후, 섬 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 흡인. 미리 데워진 프로테오리틱 및 콜라주 용 효소 혼합물의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 파이펫은 P1000 파이펫을 사용하여 섬을 혼합합니다.
섭씨 37도에서 5분간 배양하세요. 인큐베이션 후 파이펫을 위아래로 부드럽게 섞는다. 단일 셀 흐림및 플레이크 수 또는 소화되지 않은 섬수를 확인합니다.
40 미크론 여과기를 35mm 페트리 접시에 넣고 CMRL 배지 1밀리리터를 10%의 열 불활성 태아 소 혈청으로 추가하고 1밀리리터 주사기 플런저로 우울하게 하여 스트레이너를 적시세요. 스트레이너 위에 있는 모든 셀 서스펜션을 전송합니다. 그리고 신선한 15 밀리리터 튜브에서 패스를 수집합니다.
섬 소화에 사용되는 튜브를 신선한 CMRL 배지0.5 밀리리터로 세척하여 남은 세포를 수집하고 여과기를 통해 세척을 전달합니다. 15 밀리리터 튜브에 패스를 결합합니다. 한 번 반복합니다.
스트레이너에 남아 있는 소화되지 않은 섬을 분리하려면 스트레이너를 1밀리리터 주사기 플런저로 누릅니다. 패스를 다시 수집하고 스트레이너를 신선한 일반 CMRL 1066 배지로 세척하여 남은 소화된 모든 섬을 여조및 접시에서 제거합니다. 패스를 15 밀리리터 튜브에 넣습니다.
세포 현탁액의 총 부피를 기록하고 혈종계에 세포 수를 계산하기 위해 세포의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 복용. 200배 g에서 5분간 세포 현탁액을 원심분리한 후, 펠릿을 방해하지 않고 배지를 제거한다. 96개의 음극저 부착판을 사용하여 의사 섬을 생성하기 위해, 먼저 단일 셀 서스펜션의 밀리리터당 10내지 10분의 1의 총 부피를 계산한다.
이어서, CMRL 배지에서 섬 펠릿을 10%의 열불불성 태아소 혈청으로 다시 일시 중단하여 세포 현탁액의 30 마이크로리터가 3000개의 세포를 갖는다. 다음으로, 단일 셀 서스펜션의 필요한 부피를 신선한 15 밀리리터 튜브로 전송합니다. 관심 또는 대조군의 유전자를 표적으로 하는 SH-RNA를 포함하는 렌즈바이러스의 세포 당 250개의 전이 단위에서.
세포 현탁액을 바이러스와 혼합하려면 P1000 파이펫과 부드럽게 5회 피펫을 섞습니다. 그런 다음 8개의 채널 파이펫을 사용하는 경우 혼합 세포를 50 밀리리터 멸균 시약 저장소로 이송합니다. 8개의 채널 파이펫 또는 P200 파이펫을 사용하면 렌즈티바이러스와 혼합된 셀 서스펜션의 웰당 30마이크로리터를 각 웰에 분배합니다.
다음으로, 7분 동안 실온에서 270배 의 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 96웰 플레이트를 원심분리합니다. 하룻밤 동안 가습 된 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 문화. 인큐베이션 후 인큐베이터에서 96 개의 웰 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛에 놓습니다.
섬당 파이펫 100 마이크로리터는 10% 높은 FBSCMRL의 섬내 건조를 방지하고 1주일 동안 계속 배양합니다. 파이프 100 마이크로 리터CMRL 매체의 우물 당 10%의 열 불활성 태아 소 혈청저수지에서 의사 섬과 파이펫을 2~3배 위아래로 부드럽게 들어 올려 섬이 들어 올립니다. 그런 다음, 의사 섬이 들어 있는 우물에서 배지를 흡인하고 10센티미터 페트리 접시로 배출한다.
모든 의사 섬의 완전한 제거를 보장하기 위해 가벼운 현미경에서 플레이트를 확인하고 다운 스트림 실험을 진행합니다. 24 마이크로 웰 배양 플레이트를 사용하여 의사 섬을 생성하려면 먼저 안티 준수 헹구는 용액의 웰 당 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 1300배 g의 원심분리기는 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 5분간.
그런 다음 현미경으로 플레이트를 관찰하여 기포가 마이크로 웰에서 제거되도록 합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서, 우물에서 안티 준수 헹도 방지 용액을 흡인. 한 번 따뜻한 일반 CMRL 1066 매체의 두 밀리리터와 함께 각각 잘 헹구는.
그런 다음, 일반 CMRL 1066 배지를 흡인하고 10%의 열 불활성 태아 소 혈청을 사용하여 따뜻한 CMRL의 웰당 0.5 밀리리터를 추가합니다. 각 웰에 필요한 총 셀 수를 결정합니다. 멸균 1.5 밀리리터 튜브에서 10%의 열 불활성 태아 소 혈청으로 CMRL 배지의 0.8 밀리리터에서 단일 세포를 다시 중단합니다.
렌티바이러스에 의해 변환된 의사 섬 의 한 우물을 만들려면, 0.2 밀리리터 이하의 바이러스의 양을 유지하는 단세포 현탁액에 세포 당 125 개의 변환 단위를 추가합니다. 세포의 응축 전에 바이러스와 세포의 접촉을 허용하기 위해 1 시간 동안 가끔 부드러운 혼합과 37 섭씨에서 세포와 바이러스 혼합물을 배양. 1시간 후, 10%의 열 불활성 태아 소 혈청을 가진 CMRL 배지를 추가하여 1밀리리터로 아슬렛 세포 및 바이러스 혼합물의 총 부피를 조정한다.
세포가 1시간 배양 후 덩어리를 형성하면 2~3회 부드럽고 빠른 파이펫을 사용하여 단일 셀 현탁액으로 분산됩니다. 셀 현탁액을 24개의 잘 미세웰 배양 플레이트 중 하나의 웰로 이송한다. 파이펫팅 직후, 원심분리기는 실온에서 100배 g에서 3분 동안 모든 마이크로 웰에 세포를 포획합니다.
현미경으로 관찰하여 세포가 모든 마이크로 웰에 균등하게 분포되어 있는지 확인하십시오. 그것은 우물에 있는 islet 단 세포 현탁액을 잘 혼합하는 것을 추가한 후에 즉시 마이크로 웰 플레이트를 원심분리하는 것이 중요합니다. 96개의 매우 낮은 부착 플레이트에서 생성된 3000개의 인간 섬 세포로부터의 의사 섬 형태에 대한 순차적 변화는 1주일 만에 매끄러운 둥근 테두리를 가진 단층 또는 느슨한 세포 덩어리로 변했다.
대조적으로, 마이크로 웰 배양 판에서, 단지 500 섬 세포에서 세포와 의사 섬의 형성은 일반적으로 4 일 이내에 볼 수 있습니다. 의사 섬의 균일한 크기는 테스트 그룹 내의 변동을 줄이고 측정당 5개의 의사 섬을 사용하여 정적 인큐베이션을 허용합니다. 인슐린 반응을 위한 페리 융합 분석은 인간 의사 섬이 문화의 7 일 후에 포도당에 응하여 강력한 첫번째 단계 인슐린 분비를 유지한 것을 보여주었습니다.
단일 세포 현탁액에 인간 지방 트리글리세라이드 리파제 또는 페리핀 5개의 유전자를 대상으로 하는 렌티바이러스의 도입은 islet 세포의 효율적이고 균일한 변환을 보장하고 유전자의 고효율 다운레그렌을 달성한다. 인간 적인 아슬렛을 단일 세포로 분산시키는 데 필요한 시간은 크기, 분포 및 기증자 특성과 같은 많은 요인에 의해 영향을 받는다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 소화 중에 인간 섬이 사라지는 데 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.
프로토콜 전반에 걸쳐 세포 손실을 피하기 위해 단일 세포 현탁액을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 생성되는 인간 의사 섬은 다음과 같은 유전자 변조의 효과를 결정하기 위해 많은 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 :웨스턴 블롯, 조직학적 연구 및 산소 소비율의 측정. 이 프로토콜은 일반적인 실험실 도자기와 간단한 기술을 사용하여 섬 건강과 인간 섬내기능의 조절에서 표적 유전자의 낮은 을 평가할 수 있게 한다.
인간 섬을 사용하면 현지 검토 위원회의 사전 승인이 필요할 수 있습니다. 연구가 시작되기 전에 현지 검토 위원회에 문의하십시오. 렌티바이러스는 생물안전 수준 2로 분류됩니다.
렌즈 바이러스의 사용개시 전에 생물안전위원회에 문의하십시오.
