Трудно модулировать экспрессию генов в человеческих островках, также большее снижение функционирования человеческих островков создают серьезные проблемы после модуляции экспрессии генов. Комбинируя лентивирус опосредованную трансдукцию SHR8 и формирование подходящих для человека островков. Этот протокол позволяет эффективно downregulation целевого гена при сохранении функции островка во время длительной культуры.
Для начала аккуратно закружить судоходную бутылку, чтобы держать островки в подвеске. Перенесите судоходную среду, содержащую островки, в 50-миллилитровую коническую центрифугу. Пусть трубка сидеть в шкафу биологической безопасности в течение 15 минут, так что островки оседают на дно трубки.
Удалите судоходство среды осторожно с помощью капиллярной пипетки, не нарушая островок гранулы. Повторно приостановить островок гранулы в среде CMRL с 1%человеческой сыворотки альбумин в концентрации 400 островок эквивалент на миллилитр. Передача островков в не-ткани культуры лечение блюдо и культуры их при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа инкубатор на ночь.
После ночной культуры, передача человеческих островков в 15 миллилитров конической центрифуги трубки, центрифуги на 250 раз г в течение пяти минут в размахивая ротором ведро. И аспирировать среды с капиллярной пипетки, не нарушая островок гранулы. Вымойте гранулы моего добавления 10 миллилитров PBS в трубку, аккуратно перемешать и центрифугу в 250 раз г в течение пяти минут.
После центрифугации, аспират PBS, не нарушая островок гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в 0,5 миллилитров предварительно разогретой протеолитической и коллагенолитической ферментной смеси. Pipette пять раз с помощью P1000 пипетки смешивать островки.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После инкубации, смешать пипетку ласки вверх и вниз мягко. Проверьте облачность одной ячейки и количество хлопьев или непереваренных островков.
Поместите 40 микрон ситечко в 35-миллиметровую чашку Петри и промокнете ситечко, добавив один миллилитр среды CMRL с 10%тепловой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода и угнетая одним миллилитровым шприцем. Перенесите всю подвесную клетку поверх ситечко. И соберите пропуск через в свежей 15 миллилитровой трубке.
Вымойте трубку, используемую для пищеварения островка с 0,5 миллилитров свежей среды CMRL для сбора оставшихся клеток и пройти мыть через ситечко. Смешайте проход через в 15 миллилитров трубки. Повторите один раз.
Чтобы отмежеваться от непереваренных островков, оставшихся на ситечко, нажмите на ситечко одним миллилитровым шприцем. Соберите пройти через снова и мыть ситечко со свежей простой CMRL 1066 среды, чтобы удалить все оставшиеся переваренные островки из ситечко и блюдо. Добавьте проход к 15 миллилитровой трубке.
Замечите общий объем клеточной подвески и возьмите 10 микролитров алицита клеток, чтобы подсчитать номер клетки на гемоцитометре. После центрифугирования клеточной суспензии в течение пяти минут при 200 раз г, удалите среду, не нарушая гранулы. Для производства псевдо-островков с помощью 96 хорошо ультра низкой пластины крепления, сначала рассчитать общий объем необходимых один раз от 10 до пятых клеток на миллилитр одноклеточной подвески.
Затем повторно приостанавливайте островок гранулы в среде CMRL с 10%-теплой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода, так что 30 микролитров клеточной суспензии имеет 3000 клеток. Затем перенесите необходимый объем одноклеточной подвески на свежую 15-миллилитровую трубку. На 250 единиц трансдукции на клетку лентивируса, содержащего SH-РНК ориентации гена интереса или контроля.
Чтобы смешать клеточной суспензии с вирусом, пипетка осторожно пять раз с P1000 пипетки. Затем перенесите смешанные клетки в 50-миллилитровый стерильный резервуар реагентов при использовании восьмиканальную пипетку. С восьмиканарной пипеткой или P200 пипеткой, обойтись 30 микролитров на колодец клеточной подвески смешивается с лентивирусом в каждой хорошо.
Далее, центрифуга 96 хорошо пластины в размахивая ведро пластины центрифуги при 270 раз г при комнатной температуре в течение семи минут. Культура при 37 градусах по Цельсию в увлажненные 5%углекислого газа инкубатор ночь. После инкубации снимите пластину 96 хорошо из инкубатора и поместите ее в шкаф биологической безопасности.
Pipette 100 микролитров на островок 10%-й FBSCMRL в колодец, чтобы предотвратить высыхание островков и продолжать культуру в течение одной недели. Pipette 100 микролитров на колодец среды CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода из резервуара для псевдо-островков и пипетки вверх и вниз два-три раза мягко в колодец, чтобы поднять островки вверх. Затем аспирировать среду в колодец, содержащий псевдо-островок и извлечь в 10 сантиметров чашку Петри.
Проверьте пластину под световым микроскопом, чтобы обеспечить полное удаление всех псевдо-островков и приступить к вниз по течению экспериментов. Для производства псевдо-островков с использованием 24 хорошо микро хорошо культуры пластины, сначала добавить 500 микролитров на колодец анти-присоединения полоскания решения. Центрифуга при 1300 раз г в течение пяти минут в размахивая ведро пластины центрифуги.
Затем наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха удаляются из микро-колодцев. В кабинете биологической безопасности, аспирировать анти-присоединения полоскания раствор из скважин. Промыть каждый колодец с двумя миллилитров теплой равнине CMRL 1066 среды один раз.
Затем, аспирировать простой CMRL 1066 среды и добавить 0,5 миллилитра на колодец теплого CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода к каждому хорошо спланированы для использования. Определите общее количество ячеек, необходимых для каждой колодец. Повторно приостанавливать одиночные клетки в 0,8 миллилитров среды CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода в стерильной 1,5 миллилитровой трубки.
Чтобы создать один колодец псевдо-островка, вызванного лентивирусом, добавьте 125 единиц трансдукции на клетку к одноклеточной подвеске, сохраняя объем вируса ниже 0,2 миллилитров. Инкубировать клеточной и вирусной смеси при 37 градусах по Цельсию с редким нежным смешивания в течение одного часа, чтобы контакт клеток с вирусом до конденсации клеток. Через час отрегулируйте общий объем островковой клетки и вирусной смеси до одного миллилитра, добавив среду CMRL с 10%-теплой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода.
Если клетки образуют комки после одного часа инкубации разойтись в одну ячейку подвески нежным и быстро pipetting два-три раза. Перенесите подвеску клетки в один колодец из 24 хорошо микро-хорошо культуры пластины. Сразу же после пипетки, центрифуга при 100 раз г при комнатной температуре в течение трех минут, чтобы захватить клетки во все микро-колодцы.
Наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены во всех микро-колодцах. Очень важно центрифуза пластины микро-хорошо сразу после добавления хорошо смешивания островок одноклеточной подвески в скважины. Последовательные изменения в морфологии псевдо-островков из 3000 клеток островков человека, созданных в 96 хорошо ультра низкой пластины крепления показали монослой или свободные скопления клеток превратились в твердые агрегаты с гладкой круглой границей в течение одной недели.
В отличие от этого, в микро-хорошо культуры пластины, формирование клеток и псевдо-островков только из 500 островков клеток, как правило, видны в течение четырех дней. Единый размер псевдо-островков уменьшает вариации в тестовой группе и позволяет статической инкубации, используя всего пять псевдо-островков на измерение. Перри Fusion Анализ инсулина ответ показал человека псевдо-островки поддерживается надежной первой фазы секреции инсулина в ответ на глюкозу после семи дней культуры.
Введение лентивируса, направленного против жировой триглицеридов липазы человека или перилипина пяти генов в одноклеточную суспензию, обеспечивает эффективную и однородную трансдукцию островковых клеток и обеспечивает высокоэффективную даунрегуляцию генов. Важно помнить, что время, необходимое для разгона человеческого островка в одиночные клетки, зависит от многих факторов, таких как: размер, распределение и характеристика донора. Поэтому важно обратить пристальное внимание на исчезновение человеческих островков во время пищеварения.
На протяжении всего протокола важно обращаться с одноклеточной подвеской мягко, чтобы избежать потери ячейки. Созданные псевдо островки человека могут быть использованы для многих приложений для определения эффекта модуляции генов, таких как: Западная пятно, гистологическое исследование и измерения показателей потребления кислорода. Этот протокол позволяет оценить низкий целевой ген в регуляции здоровья островков и функции в человеческих островках с помощью общей лабораторной посуды и простых методов.
Использование человеческих островков может потребовать предварительного одобрения со стороны местного совета по обзору. Пожалуйста, проконсультируйтесь с местным советом по обзору до начала исследования. Лентивирус классифицируется как уровень биобезопасности два.
Обратитесь в комитет по биобезопасности до начала использования лентивируса.
