确定小鼠肝脏中的胆汁密度

该协议使研究人员能够量化小鼠肝脏疾病模型中的胆管发育。它还允许评估遗传修饰剂对胆管发育的影响。该技术的优点是，它是直接评估胆管发育的直接、敏感和定量的方法。

首先，用钳子紧绷的皮肤，用小剪刀做一个横向切口约一英寸的排骨下，安乐死鼠标的肋骨笼。暴露肝脏的整个腹体表面。使用小剪刀小心地切开连接肝脏和腹部其他器官的韧带。

然后，切开普通胆管，将肝脏从肠道中分离出来。抓住胆囊，小心切除肝脏。立即将它放在一个50毫升的管子中，用4%的甲醛填充四分之三。

要修复肝脏组织，在4摄氏度下孵育4%PFA，48小时。一系列乙醇洗涤后，在室温下用清除剂清洗肝脏三次，每次洗涤30分钟。要开始嵌入，在组织模具中清洗组织盒三次，用预热至60摄氏度的石蜡30分钟。

然后，用石蜡填充组织模具至四分之三高，并在60摄氏度的加热块上保持。将肝脏放在模具中，腹侧朝上。小心地从加热块中取出模具后，将盒式磁带的顶部放在模具上。

用热液体石蜡顶上，让其冷却到室温过夜。从模具中取出肝脏块后，使用微切子开始切分肝脏的表层侧，进行五微米的切块。在解剖显微镜下检查表面部分，确保截面不会剪切或折叠。

要处理免疫组化学的幻灯片，选择每个基因型的幻灯片进行分析，用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇和最后70%乙醇洗涤15分钟。在电离水中清洗幻灯片后，将其浸入基于 Tris 的高 pH 抗原检索溶液中。然后，在压力锅中在压力下加热三分钟，每平方英寸 10 磅。

使幻灯片冷却到室温后，使用 PAP 笔勾勒出幻灯片上的各部分。使用 PBS Tween 洗涤后，通过添加 100 微升的阻滞溶液，每节和孵育覆盖在 4 摄氏度一个小时， 堵塞组织部分。将含有所有三种原抗体的稀释抗体溶液的100微升应用到每个部分，并在4摄氏度下孵育。

洗涤幻灯片后，加入100微升的二次抗体溶液，同时含有二次抗体，并在室温下孵育一小时。最后，在幻灯片上应用安装介质和盖玻片。使用荧光显微镜以每个部分的 1 倍变焦拍摄 20 倍图像。

确保肝脏的每个入口静脉都成像。创建包含以下列的电子表格：动物/样本编号、图像编号、门户静脉数和胆管数量。识别并记录每个图像的门户静脉数。

然后，通过围绕可定义的流明的胆血管细胞的存在，识别每个图像中的专利胆汁导管。这些结构应该不同，由与其他广谱细胞素阳性细胞分离。这项技术的一个主要挑战是识别专利胆汁导管。

确定什么是专利管道需要分析管道的形状和流明周围的细胞。计算每个专利胆管，并放在与图像编号相同的列中，并重复每个门户静脉图像。最后，计算肝脏样本中所有入口静脉和所有胆管的总和，并计算肝脏样本的胆管与门户静脉比率。

P30小鼠肝脏被分段并共同染色的CK8和CK19以及血管标记，α-SMA，以确定BD到PV的比例。当每个肝叶的所有入口静脉被成像时，入口静脉被定义为具有相邻广谱细胞角蛋白染色的α-SMA染色血管。没有广谱细胞素的α-SMA染色结构是被排除在分析之外的中心静脉。

专利管道具有明确定义的流明，周围环绕着广谱细胞素阳性胆管，通常通过中游分离出附近的导管或胆管细胞。没有可定义流明的广谱细胞角蛋白阳性细胞不计入胆管总数。野生动物的肝脏部分显示了与完全专利管道以及几个未合并细胞相关的入口静脉。

来自JAG1异质动物的代表性肝脏部分显示，三个入口静脉周围不存在专利胆管。这里所有的广谱细胞角素阳性细胞都是未合并的，因此，不应计算在内。对三种野生型动物和三种JAG1异型动物的BD与PV比率的分析表明，如何根据胆管计数可以方便地区分这两种基因型。

评估胆管的所有入口容器非常重要。如果肝脏存在表型变异性，它对于确定胆管密度尤为重要。该技术用于鉴定赫尔加森小鼠模型中胆道表型的遗传抑制器。

因此，它可能有助于评估胆道疾病动物模型的治疗模式。