このプロトコルは、研究者が肝臓病のマウスモデルにおける胆管の発達を定量化することを可能にする。また、胆管の開発に対する遺伝的修飾剤の影響を評価することを可能にする。この技術の利点は、胆管の開発の直接評価のための簡単で、敏感で、定量的な方法であるということです。
まず、皮膚を鉗子で張り付けて、小さなはさみを使って、安楽死させたマウスの肋骨ケージの約1インチ下に横断切開を行います。肝臓の腹側表面全体を露出させます。小さいはさみを使用して、肝臓と腹部の他の器官をつなぐ靭帯を慎重に切断します。
次いで、共通の胆管を切断し、肝臓を腸から切り離す。胆嚢につかまって、慎重に肝臓を取り除きます.すぐに4%パラホルムアルデヒドで充填50ミリリットルチューブを4分の3に入れます。
肝臓組織を固定するには、4%PFAを摂氏4度で48時間インキュベートする。一連のエタノール洗浄後、クリア剤で肝臓を室温で30分間3回洗浄します。埋め込みを開始するには、組織カセットを組織モールドで3回30分間、摂氏60度に予熱したパラフィンワックスで洗浄します。
その後、パラフィンワックスで組織モールドを4分の3の高さに充填し、摂氏60度の加熱ブロックに保管します。腹側を上に向けて、肝臓を型に入れます。慎重に加熱ブロックから金型を取り外した後、カセットの上部を金型の上に置きます。
熱い液体パラフィンを上にして、一晩室温まで冷却させます。肝臓ブロックを型から取り出した後、ミクロトームを使用して肝臓の表面的な後側を切り離し、5マイクロメートルの切片を作ります。解剖顕微鏡の下の表面的なセクションをチェックして、セクションがせせられたり折り畳まれたりしていないことを確認してください。
免疫検査用のスライドを処理するには、分析する遺伝子型ごとに1つのスライドを選択し、キシレン、100%エタノール、95%エタノール、そして最後に70%エタノールで15分間洗浄します。スライドをイオン化水に洗浄した後、トリスベースの高pH抗原検索溶液に浸漬する。その後、圧力鍋で圧力を受けて1平方インチあたり10ポンドで3分間加熱します。
スライドを室温まで冷やした後、PAP ペンを使用してスライドのセクションの概要を説明します。PBS Tweenで洗浄した後、セクションあたり100マイクロリットルのブロッキング溶液を加えて組織切片をブロックし、摂氏4度で1時間覆われたインキュベートを行います。3つの一次抗体すべてを含む希釈抗体溶液の100マイクロリットルを各セクションに塗布し、一晩摂氏4度でインキュベートします。
スライドを洗浄した後、二次抗体を含む2次抗体溶液の100マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートする。最後に、取り付け媒体とカバースリップをスライドに適用します。蛍光顕微鏡を使用して、各セクションの1倍ズームで20倍の画像を撮影します。
肝臓全体のすべての門脈が画像化されていることを確認します。次の列を使用してスプレッドシートを作成します:動物/サンプル番号、画像番号、ポータル静脈の数と胆管の数。各画像の画像ごとのポータルの静脈の数を識別し、記録します。
次に、各画像の特許胆管を、定義可能な内腔を取り囲む胆管の存在によって同定する。これらの構造は、他の広域スペクトルサイトケラチン陽性細胞から区別され、間質によって分離されるべきである。この技術の主な課題の1つは、特許胆管の同定です。
パテントダクトが何であるかを決定するには、ダクトの形状と内腔を取り巻く細胞の分析が必要です。各特許胆管をカウントし、画像番号と同じ列に配置し、各ポータルの静脈画像について繰り返します。最後に、肝臓サンプル内のすべての門脈と胆管の合計を計算し、肝臓サンプルの胆管と門脈の比率を計算します。
P30マウス肝臓は、CK8およびCK19について、血管マーカーと共に切除し、共染色し、α-SMA、BD対PV比を決定した。各肝葉のすべての門脈が画像化されると、門脈は隣接する広域スペクトルサイトケラチン染色を有するα-SMA染色血管として定義された。広域スペクトルサイトケラチンを含まないα-SMA染色構造は、分析から除外された中央静脈であった。
パテントダクトは、広いスペクトルのサイトケラチン陽性胆管数減少に囲まれた明確に定義可能なルーメンを有し、通常は近くの管または雑管から間線葉によって分離される。定義可能な内腔を有しない広域シトケラチン陽性細胞は、胆管の総数にカウントされない。野生型動物由来の肝臓部は、いくつかの非法人細胞と共に完全特許ダクトに関連する門脈を示す。
JAG1ヘテロ接動物由来の代表的な肝切れ目は、3つの門脈の周囲に特許胆管が存在しない。ここですべての広域スペクトルサイトケラチン陽性細胞は非法人であり、したがって、カウントされるべきではありません。3つの野生型および3つのJAG1ヘテロ接合動物のBD対PV比の分析は、胆管数に基づいて2つの遺伝子型を容易に区別する方法を示している。
胆管のすべての門脈を評価することが重要です。肝臓全体にフェオチの変動がある場合は、胆管密度を決定するために特に重要です。.この技術は、ヘルガソンのマウスモデルにおける胆道表現型の遺伝的抑制剤を同定するために使用された。
したがって、胆道疾患の動物モデルの治療様式を評価するのに有用であり得る。
