이 프로토콜은 조사자가 간 질환의 마우스 모델에서 담관 개발을 정량화 할 수 있게합니다. 그것은 또한 담관 개발에 유전 수정자의 효과 평가에 대 한 허용. 이 기술의 장점은 담관 개발의 직접 평가를 위한 간단하고 민감하며 정량적인 방법이라는 것입니다.
먼저, 포셉에 의해 팽팽하게 피부가 고정되어 있는 가운데, 작은 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 갈비뼈 아래 약 1 인치 의 횡절개를 합니다. 간 의 전체 복부 표면을 노출. 작은 가위를 사용하여 복부에 있는 그밖 기관에 간을 연결하는 인대를 주의 깊게 잘라냅니다.
그런 다음 일반적인 담관을 잘라 내어 장에서 간을 분리합니다. 담낭을 잡고 간을 조심스럽게 제거하십시오. 즉시 4 %의 파라 포름알데히드로 3 분기 가득 50 밀리리터 튜브에 배치합니다.
간 조직을 해결하려면 48 시간 동안 섭씨 4도에서 4 %의 PFA로 배양하십시오. 일련의 에탄올 세척 후, 실온에서 각각 30 분 동안 클리어링 에이전트로 간을 세 번 씻으릅니다. 포함을 시작하려면, 60섭씨까지 예열된 파라핀 왁스에서 30분 동안 티슈 몰드에 티슈 카세트를 세 번 씻는다.
그런 다음, 3 분기 높이에 파라핀 왁스로 조직 금형을 채우고 섭씨 60도에서 가열 블록에 보관하십시오. 복부 쪽이 위로 향하여 금형에 간을 놓습니다. 가열 블록에서 금형을 조심스럽게 제거 한 후, 금형에 카세트의 상단을 배치합니다.
뜨거운 액체 파라핀으로 위로 얹고 밤새 실온으로 식힙니다. 곰팡이에서 간 블록을 제거 한 후, 미세 토메를 사용하여 간 표면 등쪽을 통해 단면화하여 5 마이크로 미터 섹션을 만듭니다. 해부 현미경의 밑에 피상적 인 단면을 확인하여 섹션이 전단되거나 접히지 않았는지 확인하십시오.
면역히스토케작용을 위한 슬라이드를 처리하려면 유전자형당 슬라이드 1개를 선택하고 자일렌, 100% 에탄올, 95%에탄올, 마지막으로 70%에탄올로 분석하여 15분 동안 세척한다. 이온화 된 물에 슬라이드를 세척 한 후, 트리스 기반의 높은 pH 항원 검색 용액에 담급. 그런 다음 평방 인치 당 10 파운드에서 3 분 동안 압력 밥솥에 압력을 가하여 가열하십시오.
슬라이드를 실온으로 식힌 후 PAP 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션을 간략하게 설명합니다. PBS Tween으로 세척한 후, 섹션당 블로킹 용액 100마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 섭씨 4도에서 배양하여 조직 섹션을 차단합니다. 각 섹션에 3개의 1차 항체를 모두 포함하는 희석된 항체 용액의 100마이크로리터를 적용하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양한다.
슬라이드를 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 이차 항체와 인큐베이터를 모두 포함하는 이차 항체 용액의 100마이크로리터를 추가한다. 마지막으로 슬라이드에 마운팅 미디엄과 커버슬립을 적용합니다. 형광 현미경을 사용하여 각 섹션의 1x 확대/축소에서 20배 이미지를 촬영합니다.
간을 가로지르는 모든 포탈 정맥이 이미지화되었는지 확인합니다. 다음 열이 있는 스프레드시트를 만듭니다: 동물/샘플 번호, 이미지 번호, 포털 정맥 수 및 담즙 덕트 수입니다. 각 이미지의 이미지당 포털 정맥 수를 식별하고 기록합니다.
그런 다음, 정의 가능한 루멘을 둘러싼 담랑고이트의 존재에 의해 각 이미지에서 특허 담관을 식별합니다. 이 구조물은 그밖 광스펙트럼 사이토케라틴 양성 세포에서 mesenchyme에 의해 구별되고 분리되어야 합니다. 이 기술의 한 가지 주요 과제는 특허 담관을 식별하는 것입니다.
특허 덕트란 무엇을 결정하는 것은 덕트의 모양과 루멘을 둘러싼 세포의 분석을 필요로 한다. 각 특허 담관을 계산하고 이미지 번호와 동일한 열에 배치하고 각 포털 정맥 이미지에 대해 반복합니다. 마지막으로, 간 샘플의 모든 포탈 정맥 및 모든 담관의 합을 계산하고 간 샘플에 대한 담관비율을 포문 정맥 비율로 계산합니다.
P30 마우스 간은 혈관 마커, 알파-SMA와 함께 CK8 및 CK19를 위해 단면화 및 공동 염색되어 BD 대 PV 비율을 결정하였다. 각 간 엽의 모든 포탈 정맥이 이미지화되면, 포탈 정맥은 인접한 광스펙트럼 사이토케라틴 염색이 있는 알파-SMA 염색 혈관으로 정의되었다. 광범위한 사이토케라틴이 없는 알파-SMA 얼룩 구조는 분석에서 제외된 중앙 정맥이었다.
특허 덕트는 광스펙트럼 시토케라틴 양성 담랑기옥예스로 둘러싸인 명백히 정의 가능한 루멘을 가지고 있으며, 일반적으로 인근 덕트 또는 담랑고이테에서 메센키메로 분리된다. 정의 가능한 루멘이없는 넓은 스펙트럼 사이토케라틴 양성 세포는 담관의 총 수로 계산되지 않습니다. 야생형 동물의 간 단면은 여러 개의 비법인 세포와 함께 완전히 특허 덕트와 관련된 포문 정맥을 나타낸다.
JAG1 이종수 동물의 대표적인 간부는 3개의 포탈 정맥 주변에 특허 담관이 존재하지 않는다는 것을 보여줍니다. 여기에 모든 넓은 스펙트럼 사이토케라틴 양성 세포는 통합되지 않으므로 계산해서는 안됩니다. 3개의 야생형 및 3개의 JAG1 이종수구동물에 대한 BD 대 PV 비율을 분석한 결과 담관 수에 기초하여 두 가지 유전자형을 쉽게 구별할 수 있는 방법을 보여줍니다.
담관에 대한 모든 포털 선박을 평가하는 것이 중요합니다. 그것은 간을 통해 표형 가변성이 있는 경우에 담관 밀도를 결정하기위한 특히 중요합니다. 이 기술은 헬가슨의 마우스 모형에 있는 담즙 표현형의 유전 억제기를 확인하기 위하여 이용되었습니다.
따라서, 담즙 질환의 동물 모델의 치료 양식에 유용할 수 있다.
