Ce protocole permet à l’investigateur de quantifier le développement des canaux biliaires dans les modèles muraux de maladie hépatique. Il permet également d’évaluer les effets des modificateurs génétiques sur le développement des canaux biliaires. L’avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple, sensible et quantitative pour l’évaluation directe du développement des canaux biliaires.
Pour commencer, avec la peau tendue par des forceps, utilisez de petits ciseaux pour faire une incision transversale d’environ un pouce sous la cage thoracique d’une souris euthanasié. Exposer toute la surface ventrale du foie. Utilisez de petits ciseaux pour couper soigneusement les ligaments reliant le foie aux autres organes de l’abdomen.
Ensuite, couper à travers le canal biliaire commun pour détacher le foie de l’intestin. Accrochez-vous à la vésicule biliaire et retirez soigneusement le foie. Placez-le immédiatement dans un tube de 50 millilitres rempli des trois quarts avec 4% de paraformaldéhyde.
Pour fixer le tissu hépatique, l’incuber en 4%PFA à quatre degrés Celsius pendant 48 heures. Après une série de lavages à l’éthanol, laver le foie avec un agent de compensation trois fois pendant 30 minutes chacun à température ambiante. Pour commencer à intégrer, laver une cassette de tissu dans un moule de tissu trois fois pendant 30 minutes dans de la cire de paraffine préchauffée à 60 degrés Celsius.
Ensuite, remplissez le moule de tissu avec de la cire de paraffine à la hauteur des trois quarts et gardez-le sur un bloc chauffant à 60 degrés Celsius. Placez le foie dans le moule avec le côté ventral face vers le haut. Après avoir soigneusement enlevé le moule du bloc chauffant, placez le dessus de la cassette sur le moule.
Garnir de paraffine liquide chaude et laisser refroidir à température ambiante pendant la nuit. Après avoir enlevé le bloc hépatique du moule, utilisez une microtome pour commencer à sectionner à travers le côté dorsal superficiel du foie, faisant cinq sections de micromètre. Vérifiez les sections superficielles sous un microscope de dissection pour vous assurer que les sections ne sont pas cisaillées ou pliées.
Pour traiter les diapositives pour l’immunohistochimie, sélectionnez une diapositive par génotype à analyser et lavez-la pendant 15 minutes en xylène, 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et enfin 70 % d’éthanol. Après avoir lavé la lame dans l’eau ionisée, immerger dans la solution de récupération d’antigènes à pH élevé à base de Tris. Ensuite, chauffez-le sous pression dans un autocuiseur pendant trois minutes à 10 livres par pouce carré.
Après avoir laissé refroidir la glissade à température ambiante, utilisez un stylo PAP pour décrire les sections de la glissière. Après le lavage avec PBS Tween, bloquer les sections tissulaires en ajoutant 100 microlitres de solution de blocage par section et d’incubation couverte à quatre degrés Celsius pendant une heure. Appliquer 100 microlitres de la solution d’anticorps dilué contenant les trois anticorps primaires à chaque section et les incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Après avoir lavé les toboggans, ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire contenant à la fois des anticorps secondaires et incuber pendant une heure à température ambiante. Enfin, appliquez un support de montage et un coverslip sur les diapositives. Utilisez un microscope fluorescent pour prendre des images 20x à 1x zoom de chaque section.
Assurez-vous que chaque veine portail à travers le foie est image. Créez une feuille de calcul avec les colonnes suivantes : numéro animal/échantillon, numéro d’image, nombre de veines portail et nombre de canaux biliaires. Identifiez et enregistrez le nombre de veines portail par image pour chaque image.
Ensuite, identifiez les canaux biliaires brevetés dans chaque image, par la présence de cholangiocytes entourant un lumen définissable. Ces structures doivent être distinctes et séparées par le mésenchyme d’autres cellules cytokératine-positives à large spectre. L’un des principaux défis de cette technique est d’identifier les canaux biliaires brevetés.
Pour déterminer ce qu’est un conduit breveté, il faut analyser la forme du conduit et les cellules entourant le lumen. Comptez chaque canal biliaire breveté et placez-le dans la même colonne que le numéro d’image et répétez pour chaque image de veine de portail. Enfin, calculez la somme de toutes les veines portails et de tous les canaux biliaires de l’échantillon de foie et calculez le rapport canal/veine portail pour l’échantillon de foie.
Les foies de souris P30 ont été sectionnés et co-tachés pour CK8 et CK19 avec le marqueur vasculaire, alpha-SMA, pour déterminer le rapport BD/PV. Lorsque toutes les veines portails de chaque lobe hépatique sont photographiées, les veines portails ont été définies comme des vaisseaux tachés alpha-SMA qui ont des taches de cytokératine à large spectre adjacentes. Les structures de tache d’alpha-SMA sans cytokeratin à large spectre étaient des veines centrales qui ont été exclues de l’analyse.
Les conduits brevetés ont un lumen clairement définissable qui est entouré de cholangioctyes cytokératine-positifs à large spectre et sont généralement séparés des conduits ou cholangiocytes voisins par le mésenchyme. Les cellules cytokératine-positives à large spectre qui n’ont pas de lumen définissable ne sont pas comptées pour le nombre total de canaux biliaires. La section hépatique d’un animal de type sauvage montre une veine portail associée à un conduit entièrement breveté ainsi que plusieurs cellules non incorporées.
La section hépatique représentative d’un animal hétérozygote JAG1 ne montre aucun canal biliaire breveté autour des trois veines portails. Toutes les cellules cytokeratine-positives à large spectre ici ne sont pas incorporées et, par conséquent, ne devraient pas être comptées. L’analyse du rapport BD/PV pour trois animaux hétérozygotes de type sauvage et trois animaux hétérozygotes JAG1 montre comment les deux génotypes peuvent être facilement distingués en fonction du nombre de canaux biliaires.
Il est important d’évaluer tous les vaisseaux portails pour les canaux biliaires. Il est particulièrement critique pour déterminer la densité des canaux biliaires s’il y a variabilité phénotypique dans tout le foie. Cette technique a été utilisée pour identifier un suppresseur génétique du phénotype biliaire dans un modèle de souris d’Helgason.
Par conséquent, il peut être utile dans l’évaluation des modalités de traitement des modèles animaux de la maladie biliaire.
