פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לכמת פיתוח צינור המרה במודלים של עכברים של מחלת כבד. זה גם מאפשר להעריך את ההשפעות של מגבילים גנטיים על התפתחות צינור המרה. היתרון של טכניקה זו הוא שזו שיטה פשוטה, רגישה וכמותית להערכה ישירה של פיתוח צינור המרה.
כדי להתחיל, עם העור מוחזק מתוח על ידי מטלאים, להשתמש במספריים קטנים כדי להפוך חתך רוחבי כ סנטימטר אחד מתחת לכלוב הצלעות של עכבר המתת דם. לחשוף את כל פני הגחון של הכבד. השתמש מספריים קטנים לחתוך בזהירות דרך הרצועות המחברות את הכבד לאיברים אחרים בבטן.
לאחר מכן, לחתוך דרך צינור המרה המשותף כדי לנתק את הכבד מהמעי. להחזיק את כיס המרה בזהירות להסיר את הכבד. מיד מניחים אותו בצינור 50 מיליליטר מלא שלושה רבעים עם 4% paraformaldehyde.
כדי לתקן את רקמת הכבד, הדגירה אותו ב 4% PFA בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאחר סדרה של שטיפות אתנול, לשטוף את הכבד עם סוכן ניקוי שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל להטביע, לשטוף קלטת רקמה בתבנית רקמה שלוש פעמים במשך 30 דקות שעווה פרפין שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, למלא את עובש הרקמה עם שעווה פרפין לגובה שלושה רבעים ולשמור אותו על בלוק חימום ב 60 מעלות צלזיוס. מניחים את הכבד בתבנית עם הצד הגחון פונה כלפי מעלה. לאחר הסרת התבנית בזהירות מבלוק החימום, מניחים את החלק העליון של הקלטת על התבנית.
למעלה עם פרפין נוזלי חם ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לילה. לאחר הסרת בלוק הכבד מהתבנית, השתמש במיקרוטום כדי להתחיל לחיתוך דרך הצד הגבי השטחי של הכבד, מה שהופך חמישה מקטעי מיקרומטר. בדוק את החלקים השטחיים תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהקטעים אינם מקופלים או מקופלים.
כדי לעבד שקופיות עבור אימונוהיסטוכימיה, בחר שקופית אחת לכל גנוטיפ כדי לנתח ולשטוף אותו במשך 15 דקות ב xylene, 100%אתנול, 95%אתנול ולבסוף, 70%אתנול. לאחר שטיפת המגלשה במים היונים, טובלים אותה בתווית אחזור אנטיגן גבוהה מבוססת טריס. לאחר מכן, מחממים אותו תחת לחץ בתוך סיר לחץ במשך שלוש דקות ב 10 ק"ג לאינץ 'מרובע.
לאחר מתן אפשרות לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר, השתמש בעט PAP כדי לחלק לרמות את המקטעים בשקופית. לאחר שטיפה עם PBS Tween, לחסום את חלקי הרקמה על ידי הוספת 100 microliters של פתרון חסימה לכל סעיף דגירה מכוסה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. החל 100 microliters של פתרון נוגדנים מדולל המכיל את כל שלושת הנוגדנים העיקריים לכל סעיף וולדגר אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה.
לאחר שטיפת המגלשות, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תותר הנוגדנים המשני המכיל נוגדנים משניים ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, החל מדיום הרכבה וכיסוי על השקופיות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצלם תמונות 20x בזום 1x של כל מקטע.
ודא כי כל וריד פורטל על פני הכבד הוא בתמונה. צור גיליון אלקטרוני עם העמודות הבאות:מספר בעלי חיים/מדגם, מספר תמונה, מספר ורידי הפורטל ומספר צינורות המרה. זהה ורשם את מספר ורידי הפורטל לתמונה עבור כל תמונה.
לאחר מכן, לזהות צינורות מרה פטנט בכל תמונה, על ידי נוכחות של cholangiocytes המקיף לומן מוגדר. מבנים אלה צריכים להיות מובחנים ומופרדים על ידי mesenchyme מתאים אחרים ספקטרום רחב cytokeratin חיובי. אחד האתגרים העיקריים של טכניקה זו הוא בזיהוי תעלות מרה פטנט.
קביעת מהו צינור פטנט דורשת ניתוח של צורת הצינור והתאים המקיפים את הלומן. ספור כל צינור מרה של פטנט והצב אותו באותה עמודה כמו מספר התמונה וחזור על הפעולה עבור כל תמונת וריד פורטל. לבסוף, לחשב את הסכום של כל ורידים פורטל וכל צינורות המרה בדגימה הכבד ולחשב את צינור המרה יחס וריד הפורטל עבור דגימת הכבד.
כבדי עכבר P30 נותקו והוכתימו במשותף עבור CK8 ו- CK19 יחד עם סמן כלי הדם, אלפא-SMA, כדי לקבוע את יחס BD ל- PV. כאשר כל ורידי הפורטל בכל אונת כבד הם בתמונה, ורידים פורטל הוגדרו כלי מוכתמים אלפא-SMA כי יש סמוך ספקטרום רחב כתם cytokeratin. מבני הכתמים אלפא-SMA ללא ציטוקראטין ספקטרום רחב היו ורידים מרכזיים אשר הוצאו מהניתוח.
תעלות פטנט יש לומן מוגדר בבירור כי הוא מוקף ציטוקרטין ספקטרום רחב חיובי cholangioctyes והם מופרדים בדרך כלל מן התעלות הסמוכות או cholangiocytes על ידי mesenchyme. תאים חיוביים cytokeratin ספקטרום רחב כי אין לומן מוגדר, אינם נספרים לקראת המספר הכולל של צינורות מרה. קטע כבד מבעל חיים מסוג בר מראה וריד פורטל הקשורים צינור פטנט מלא יחד עם מספר תאים מאוגדים.
קטע כבד נציג מבעל חיים הטרוזיגוס JAG1 מראה שאין תעלות מרה פטנט נמצאים סביב שלושת ורידים פורטל. כל התאים החיוביים של ציטוקרטין בספקטרום רחב כאן אינם מאוגדים ולכן אין לספור אותם. ניתוח יחס BD ל- PV עבור שלושה סוגים פראיים ושלושה בעלי חיים הטרוזיגים JAG1 מראה כיצד ניתן להבדיל בין שני הגנוטיפים בקלות בהתבסס על ספירת צינור המרה.
חשוב להעריך את כל כלי הפורטל עבור צינורות מרה. זה קריטי במיוחד לקביעת צפיפות צינור המרה אם יש שונות פנוטיפית על פני הכבד. טכניקה זו שימשה לזיהוי מדכא גנטי של פנוטיפ המרה במודל העכבר של הלגסון.
לכן, זה עשוי להיות שימושי בהערכת מודלים טיפוליים של מודלים של בעלי חיים של מחלת מרה.
