Этот протокол позволяет исследователю количественно развития желчных протоков в мышиных моделях заболеваний печени. Это также позволяет оценить влияние генетических модификаторов на развитие желчных протоков. Преимущество этого метода заключается в том, что он является простым, чувствительным и количественным методом для прямой оценки развития желчных протоков.
Для начала, с кожей, протянутой натянутой на типсы, используйте небольшие ножницы, чтобы сделать поперечный разрез примерно на один дюйм ниже грудной клетки усыпляемой мыши. Выставить всю вентраловую поверхность печени. Используйте небольшие ножницы, чтобы тщательно прорезать связки подключения печени к другим органам в животе.
Затем прорезать общий желчный проток, чтобы отделить печень от кишечника. Держитесь за желчный пузырь и тщательно удалите печень. Немедленно поместите его в 50 миллилитровую трубку заполнены три четверти с 4%paraformaldehyde.
Чтобы исправить ткани печени, инкубировать его в 4%PFA при четырех градусах по Цельсию в течение 48 часов. После серии этанола моет, мыть печень с очистки агента три раза в течение 30 минут каждый при комнатной температуре. Чтобы начать встраивание, мыть кассету ткани в форме ткани три раза в течение 30 минут в парафиновый воск разогрет до 60 градусов по Цельсию.
Затем заполните ткань плесень с парафиновым воском до трех четвертей высоты и держать его на нагревательный блок при 60 градусов по Цельсию. Поместите печень в форму с брюшной стороны лицом вверх. После тщательного удаления формы из нагревательного блока, поместите верхнюю часть кассеты на форму.
Доверйте с горячим жидким парафином и дайте ему остыть до комнатной температуры на ночь. После удаления блока печени из формы, использовать микротом, чтобы начать секционирование через поверхностную спинную сторону печени, делая пять микрометровых секций. Проверьте поверхностные секции под микроскопом вскрытия, чтобы убедиться, что секции не снотворные или сложенные.
Для обработки слайдов для иммуногистохимии, выберите один слайд на генотип, который будет проанализирован и мыть его в течение 15 минут в ксилена, 100% этанола, 95% этанола и, наконец, 70% этанола. После мытья слайда в ионизированной воде, погрузите его в Tris основе высокого рН антиген поиска раствора. Затем, нагреть его под давлением в скороварке в течение трех минут на 10 фунтов на квадратный дюйм.
После того, как слайд остынет до комнатной температуры, используйте ручку PAP, чтобы наметить разделы на слайде. После мытья с PBS Tween, блокировать секции тканей, добавив 100 микролитров блокирующего раствора на секцию и инкубировать покрыты при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Нанесите 100 микролитров раствора разбавленного антитела, содержащего все три первичных антитела, на каждый раздел и инкубировать их при четырех градусах Цельсия за одну ночь.
После мытья слайдов добавьте 100 микролитров вторичного раствора антител, содержащих как вторичные антитела, так и инкубации в течение одного часа при комнатной температуре. Наконец, нанесите на слайды монтажную среду и крышку. Используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы сделать 20-х изображений при 1-м увеличении каждого раздела.
Убедитесь, что каждый портал вены по всей печени изображен. Создайте электронную таблицу со следующими столбцами: номер животного/образца, номер изображения, количество вен портала и количество желчных протоков. Определите и замитмить количество вен портала на изображение для каждого изображения.
Затем определите патентные желчные протоки на каждом изображении, по наличию холангиоцитов, окружающих определяемый люмен. Эти структуры должны быть отделены и отделены мезенхимом от других цитокератин-положительных клеток широкого спектра действия. Одной из основных задач этого метода является выявление патентных желчных протоков.
Определение того, что является патентным каналом, требует анализа формы протока и клеток, окружающих люмен. Подсчитайте каждый патентный желчный проток и поместите в ту же колонку, что и число изображений, и повторите для каждого изображения вены портала. Наконец, рассчитать сумму всех вен портала и всех желчных протоков в образце печени и рассчитать соотношение желчных протоков к порталу вены для образца печени.
P30 мыши печени были секционированы и совместно окрашенных для CK8 и CK19 вместе с сосудистым маркером, альфа-SMA, чтобы определить соотношение BD к PV. Когда все вены портала в каждой доле печени изображены, портал вены были определены как альфа-SMA окрашенных сосудов, которые имеют смежные широкого спектра спектра цитокератина окрашивания. Альфа-SMA пятна структур без широкого спектра цитокератина были центральные вены, которые были исключены из анализа.
Патентные протоки имеют четко определяемый люмен, который окружен цитокератин-положительными холангиоктами широкого спектра и обычно отделен от близлежащих протоков или холангиоцитов мезенхимом. Широкочастотные цитокератин-положительные клетки, не имеют определяемого люмена, не учитываются в общем количестве желчных протоков. Раздел печени от животного дикого типа показывает портвейн вены, связанные с полностью патентным каналом вместе с несколькими неинкорпорированными клетками.
Представитель печени разделе от JAG1 гетерозиготных животных показывает, никаких патентных желчных протоков присутствуют вокруг трех вен портала. Все цитокератин-положительные клетки широкого спектра действия здесь неинкорпорированы и поэтому не должны считаться. Анализ соотношения BD к PV для трех диких и трех гетерозиготных животных JAG1 показывает, как можно легко отличить два генотипа на основе количество желчных протоков.
Важно оценить все портвейные сосуды для желчных протоков. Это особенно важно для определения плотности желчных протоков, если есть фенотипическая изменчивость по всей печени. Этот метод был использован для выявления генетического супрессора фенотипа желчных в мышиной модели Хельгасона.
Поэтому он может быть полезен при оценке методов лечения животных моделей желчных заболеваний.
