Questo protocollo consente allo sperimentatore di quantificare lo sviluppo del condotto biliare nei modelli di topo di malattia epatica. Consente inoltre di valutare gli effetti dei modificatori genetici sullo sviluppo del condotto biliare. Il vantaggio di questa tecnica è che è un metodo semplice, sensibile e quantitativo per la valutazione diretta dello sviluppo del condotto biliare.
Per iniziare, con la pelle tenuta tesa dalle forbici, usa piccole forbici per fare un'incisione trasversale circa un pollice sotto la gabbia toracica di un topo eutanasiato. Esporre l'intera superficie ventrale del fegato. Utilizzare piccole forbici per tagliare con cura i legamenti che collegano il fegato agli altri organi dell'addome.
Quindi, tagliare attraverso il condotto biliare comune per staccare il fegato dall'intestino. Tenere la cistifellea e rimuovere con cura il fegato. Posizionarlo immediatamente in un tubo da 50 millilitri riempito tre quarti con paraformaldeide al 4%.
Per fissare il tessuto epatico, incubarlo in PFA al 4% a quattro gradi Celsius per 48 ore. Dopo una serie di lavaggi di etanolo, lavare il fegato con agente di compensazione tre volte per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Per iniziare l'incorporamento, lavare una cassetta di tessuto in uno stampo tissutale tre volte per 30 minuti in cera di paraffina preriscaldata a 60 gradi Celsius.
Quindi, riempire lo stampo di tessuto con cera di paraffina a tre quarti di altezza e tenerlo su un blocco riscaldante a 60 gradi Celsius. Posizionare il fegato nello stampo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Dopo aver rimosso con cura lo stampo dal blocco riscaldante, posizionare la parte superiore della cassetta sullo stampo.
Completa con paraffina liquida calda e lascialo raffreddare a temperatura ambiente durante la notte. Dopo aver rimosso il blocco epatico dallo stampo, utilizzare un microtomo per iniziare a sessare attraverso il lato dorsale superficiale del fegato, facendo cinque sezioni di micrometro. Controllare le sezioni superficiali al microscopio a dissezione per assicurarsi che le sezioni non siano tranciate o piegate.
Per elaborare le diapositive per l'immunoistochimica, selezionare una diapositiva per genotipo da analizzare e lavarla per 15 minuti in xilene, 100% etanolo, 95% etanolo e, infine, 70%etanolo. Dopo aver lavato lo scivolo nell'acqua ionizzata, immergerlo nella soluzione di recupero dell'antigene ad alto pH a base di Tris. Quindi, scaldarlo sotto pressione in una pentola a pressione per tre minuti a 10 libbre per pollice quadrato.
Dopo aver lasciato raffreddare lo scivolo a temperatura ambiente, utilizzare una penna PAP per delineare le sezioni della diapositiva. Dopo il lavaggio con PBS Tween, bloccare le sezioni tissutali aggiungendo 100 microlitri di soluzione di blocco per sezione e incubare coperti a quattro gradi Celsius per un'ora. Applicare 100 microlitri della soluzione anticorpale diluita contenente tutti e tre gli anticorpi primari su ogni sezione e incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte.
Dopo aver lavato le diapositive, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria contenente sia anticorpi secondari che incubare per un'ora a temperatura ambiente. Infine, applicare il supporto di montaggio e un coverslip alle diapositive. Usa un microscopio fluorescente per scattare immagini 20x con uno zoom 1x di ogni sezione.
Assicurarsi che ogni vena porta attraverso il fegato sia immagine. Creare un foglio di calcolo con le colonne seguenti:Numero animale/campione, Numero di immagine, numero di vene del portale e numero di dotti biliari. Identificare e registrare il numero di vene portale per immagine per ogni immagine.
Quindi, identificare i dotti biliari brevettati in ogni immagine, dalla presenza di conlangiociti che circondano un lume definibile. Queste strutture dovrebbero essere distinte e separate dal mesenchima da altre cellule positive alla citocheratina ad ampio spettro. Una sfida principale di questa tecnica consiste nell'identificare i dotti biliari brevettati.
Determinare cos'è un condotto brevettato richiede un'analisi della forma del condotto e delle cellule che circondano il lume. Contare ogni condotto biliare brevettato e posizionarlo nella stessa colonna del numero di immagine e ripetere per ogni immagine della vena del portale. Infine, calcola la somma di tutte le vene portale e di tutti i dotti biliari nel campione di fegato e calcola il rapporto bile condotto/vena portale per il campione di fegato.
I fegati del topo P30 sono stati sesati e co-macchiati per CK8 e CK19 insieme al marcatore vascolare, alfa-SMA, per determinare il rapporto BD-PV. Quando tutte le vene portale in ogni lobo epatico sono state immagini, le vene portale sono state definite come vasi macchiati alfa-SMA che hanno una colorazione adiacente della citocheratina ad ampio spettro. Le strutture di macchie alfa-SMA senza citocheratina ad ampio spettro erano vene centrali che sono state escluse dall'analisi.
I condotti dei brevetti hanno un lume chiaramente definibile che è circondato da cholangioctyes positive alla citocheratina ad ampio spettro e di solito sono separati da condotti o colinogiociti vicini dal mesenchima. Le cellule citocheratina-positive ad ampio spettro che non hanno un lume definibile, non vengono conteggiate per il numero totale di dotti biliari. La sezione epatica di un animale di tipo selvatico mostra una vena portale associata a un condotto completamente brevettato insieme a diverse cellule non incorporate.
La sezione epatica rappresentativa di un animale eterozigote JAG1 non mostra che non siano presenti dotti biliari brevettati intorno alle tre vene del portale. Tutte le cellule citocheratine-positive ad ampio spettro qui non sono incorporate e quindi non devono essere conteggiate. L'analisi del rapporto BD/PV per tre animali eterozigoti jag1 mostra come i due genotipi possano essere facilmente distinti in base al numero di dutti biliari.
È importante valutare tutte le navi portale per i dotti biliari. È particolarmente importante per determinare la densità del condotto biliare se c'è variabilità fenotipico nel fegato. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare un soppressore genetico del fenotipo biliare in un modello di topo di Helgason.
Pertanto, può essere utile per valutare le modalità di trattamento dei modelli animali di malattia biliare.
