向外观察:分离氰化物释放的碳水化合物聚合物和蛋白质

我们开发的这些协议对于研究蓝藻及其释放的产品，即细胞外碳水化合物聚合物和蛋白质的分泌机制非常重要。所产生的知识将使我们能够定制这些产品的几个应用，即生物技术和生物医学应用。这些协议非常简单。

它们可以根据生产有机体、用户需求和产品的最终应用进行定制。这些协议的主要优点是，它们可以很容易地适应其他生物系统，特别是其他细菌。这些协议很简单。

然而，根据细菌菌株或所需的纯度程度，可能需要引入一些变化。首先，在标准条件下培养蓝藻菌株。使用标准协议衡量增长。

接下来，将培养物转移到透析膜中，对至少10卷去化水进行透析，持续搅拌24小时。在4摄氏度下将培养在15，000倍g下离心15分钟。将上经剂转移到新小瓶中，然后丢弃颗粒。

在4摄氏度下以20，000倍g再次离心15分钟，以去除污染物，如细胞壁碎片或脂质糖。离心后，将上经剂转移到玻璃烧杯上，然后丢弃颗粒。为了沉淀聚合物，在上总应物中加入两卷96%乙醇，并在一夜之间在4摄氏度下孵育悬浮液。

对于少量或不可见的沉淀聚合物，在4摄氏度下以13，000倍g离心，25分钟。轻轻丢弃上一杯，将颗粒重新在一到两毫升的自洗脱化水中。将水悬浮液转移到小瓶中。

对于可见、大量沉淀聚合物，将沉淀的聚合物与无菌金属钳收集到小瓶中。挤压聚合物，丢弃多余的乙醇。要执行冻干过程（也称为冻干），请将小瓶与沉淀的聚合物一起保持零下 80 摄氏度过夜。

使聚合物干干至少48小时。然后，将干燥的聚合物储存在室温下干燥器中，直到进一步使用。要集中培养，首先在标准条件下培养蓝藻。

使用标准程序监测蓝藻的生长。然后，在室温下以4000倍g离心，10分钟。将上一液转移到烧瓶中，然后丢弃细胞颗粒。

接下来，通过 0.2 微米孔径过滤器过滤已脱芯介质。要浓缩介质约500次，请使用具有标称分子量的离心浓缩器，将4000倍g和15摄氏度的离心离心机离心，最大为1小时离心。离心后，用浓缩样品冲洗过滤装置样品储液罐壁，将含量转移到微离心管中。

使用自洗培养培养介质对过滤装置样品储液罐执行额外的洗涤步骤，以确保最大限度的外蛋白回收。然后，将外蛋白样本储存在零下20摄氏度，直到进一步使用。必须大力添加乙醇，以优化聚合物的沉淀和产量。

离心沉淀聚合物后，应小心地丢弃上先液，以避免可能松散地附着在烧瓶壁上的颗粒重新附着。如果进行手动过滤，则应温和避免破坏滤膜。一些沉淀的聚合物只有在离心后才能看到，主要是在烧瓶的墙壁上，例如来自Synechocystis的EPS。

在其他情况下，如氰化聚合物，可以看到聚合物团在沉淀后漂浮在玻璃烧杯中。一些污染在聚合物冻干后很容易从宏观上检测，因为它们会改变聚合物色素沉着，通常是白色或浅棕色。橙色聚合物被含有这些色素的类胡萝卜素或结构污染。

例如，绿色聚合物受到细胞碎片和叶绿素的污染。外蛋白组可能因细菌菌株而有显著差异。例如，参见来自单细胞蓝藻的外蛋白组和来自丝状菌株的外蛋白。

外蛋白集中样品中多糖的大量数量会阻碍外蛋白组分析。例如，它可以延迟蛋白质分离和掩盖较少丰富的蛋白质。用户可以从成分、物理/化学性质、测试聚合物生物活性或改性聚合物成分方面对聚合物进行特征描述。

对于蛋白质鉴定，可以进行凝胶中的蛋白质分离和质谱法。对于囊泡的分离，应进行外蛋白的超离心。在我们的小组中，这些协议已经为解开蓝藻分泌机制或细胞外碳水化合物聚合物在不同领域的应用铺平了道路，例如在生物修复或抗肿瘤或药物输送剂中。