Questi protocolli che abbiamo sviluppato sono importanti per studiare i meccanismi di secrezione nei cianobatteri e nei loro prodotti rilasciati, vale a dire i polimeri e le proteine dei carboidrati extracellulari. Le conoscenze generate ci permetteranno di personalizzare questi prodotti per diverse applicazioni, ovvero applicazioni biotecnologiche e biomediche. Questi protocolli sono molto semplici.
Possono essere personalizzati in base all'organismo produttore, alle esigenze dell'utente e all'applicazione finale del prodotto. Il vantaggio principale di questi protocolli è che possono essere facilmente adattati ad altri sistemi viventi, in particolare ad altri batteri. Questi protocolli sono facili.
Tuttavia, potrebbe essere necessario introdurre alcuni cambiamenti a seconda del ceppo batterico o del grado di purezza richiesto. Per iniziare, coltivare il ceppo cianobatterico in condizioni standard. Misurare la crescita utilizzando protocolli standard.
Successivamente, trasferire la coltura in membrane dialisi e dializzare contro un minimo di 10 volumi di acqua deionizzata per 24 ore con agitazione continua. Centrifugare la coltura a 15.000 volte g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire il supernatante in una nuova fiala e scartare il pellet.
Centrifugare di nuovo a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere i contaminanti, come detriti della parete cellulare o lipopaccaridi. Dopo la centrifugazione, trasferire il supernatante in un bicchiere di vetro e scartare il pellet. Per far precipitare il polimero, aggiungere due volumi di 96% di etanolo al supernatante e incubare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte.
Per piccole o non visibili quantità di polimero precipitato, centrifugare la sospensione a 13.000 volte g a quattro gradi Celsius per 25 minuti. Scartare delicatamente il supernatante e rimescolare il pellet in uno o due millilitri di acqua deionizzata autoclavata. Trasferire la sospensione acquosa su una fiala.
Per le grandi quantità visibili di polimero precipitato, raccogliere il polimero precipitato con forceli metallici sterili su una fiala. Spremere il polimero e scartare l'etanolo in eccesso. Per eseguire il processo di liofilizzazione altrimenti noto come liofilizzazione, mantenere le fiale con il polimero precipitato a meno 80 gradi Celsius durante la notte.
Licofilizzare il polimero per almeno 48 ore. Quindi, conservare il polimero essiccato in un essiccatore a temperatura ambiente fino a un ulteriore utilizzo. Per concentrare il mezzo, prima coltivare i cianobatteri in condizioni standard.
Monitorare la crescita del cianobatterio utilizzando procedure standard. Quindi, centrifugare le colture a 4.000 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire il supernatante in un pallone e scartare il pellet cellulare.
Quindi, filtrare il mezzo decantato attraverso un filtro di dimensioni dei pori da 0,2 micron. Per concentrare il mezzo circa 500 volte, utilizzare concentratori centrifughe con un taglio nominale del peso molecolare di tre kilodalton per centrifugare 4.000 volte g e 15 gradi Celsius per un massimo di un'ora per tondo di centrifugazione. Dopo la centrifugazione, sciacquare le pareti del serbatoio del campione del dispositivo filtrante con il campione concentrato e trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifugo.
Eseguire una fase di lavaggio aggiuntiva del serbatoio del campione del dispositivo filtrante con il mezzo di coltura autoclavato per garantire il massimo recupero dell'esoproteoma. Quindi, conservare i campioni di esoproteoma a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. L'etanolo deve essere aggiunto vigorosamente per ottimizzare la precipitazione e la resa del polimero.
Dopo aver centrifugato il polimero precipitato, lo scarto del supernatante deve essere fatto con attenzione al fine di evitare la resuspensione del pellet che può essere attaccato liberamente sulla parete del pallone. Se viene eseguita la filtrazione manuale, dovrebbe essere delicato per evitare di rompere la membrana del filtro. Alcuni polimeri precipitati possono essere visibili solo dopo la centrifugazione, principalmente sulle pareti dei contenitori, come il caso dell'EPS di Synechocystis.
In altri casi, come il polimero di cianoteca, è possibile vedere i grumi polimerici galleggiare nel becher di vetro subito dopo le precipitazioni. Alcune contaminazioni possono essere facilmente rilevate macroscopicamente dopo la liofilizzazione dei polimeri poiché altereranno la pigmentazione polimerica, di solito bianca o marrone chiaro. I polimeri arancioni sono contaminati da carotenoidi o strutture contenenti questi pigmenti.
Ad esempio, i polimeri verdi sono contaminati da detriti cellulari e clorofilla. Gli esoproteomi possono variare in modo significativo a seconda del ceppo batterico. Vedi, ad esempio, l'esoproteoma di un cianobatterio unicellulare e quello di un ceppo filamentoso.
L'elevata quantità di polisaccaridi nei campioni concentrati di esoproteoma può ostacolare l'analisi dell'esoproteoma. Ad esempio, può ritardare la separazione proteica e mascherare proteine meno abbondanti. L'utente può caratterizzare il polimero in termini di composizione, proprietà fisiche/chimiche, attività biologica del polimero di prova o componenti polimerici modificati.
Per l'identificazione delle proteine, è possibile eseguire la separazione delle proteine in gel e spettrometria di massa. E per la separazione delle vescicole, deve essere eseguita l'ultracentrifugazione dell'esoproteoma. Nel nostro gruppo, questi protocolli hanno già spianato la strada a svelare meccanismi di secrezione cianobatterica o applicazioni dei polimeri di carboidrati extracellulari in diversi campi, come nel bioremediazione o come antitumore o agenti di somministrazione di farmaci.
