هذه البروتوكولات التي وضعناها مهمة لدراسة آليات إفراز في البكتيريا الزرقاء ومنتجاتها الصادرة، وهي بوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات خارج الخلية. المعارف المتولدة سوف تسمح لنا لتخصيص هذه المنتجات لعدة تطبيقات، وهي تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. هذه البروتوكولات واضحة جدا.
ويمكن أن تكون مصممة وفقا للكائنات المنتجة ، واحتياجات المستخدم ، والتطبيق النهائي للمنتج. والميزة الرئيسية لهذه البروتوكولات هي أنها يمكن أن تتكيف بسهولة مع النظم الحية الأخرى، ولا سيما مع البكتيريا الأخرى. هذه البروتوكولات سهلة.
ومع ذلك، قد يحتاج المرء لإدخال بعض التغييرات اعتمادا على سلالة بكتيرية أو درجة النقاء المطلوبة. للبدء ، زراعة سلالة البكتيريا الزرقاء في ظل الظروف القياسية. قياس النمو باستخدام بروتوكولات قياسية.
بعد ذلك، نقل الثقافة إلى أغشية غسيل الكلى، و dialyze ضد ما لا يقل عن 10 كميات من المياه ديونسيد لمدة 24 ساعة مع اثارة مستمرة. جهاز طرد مركزي في الثقافة في 15،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل افرا إلى قارورة جديدة، والتخلص من بيليه.
مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي في 20،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الملوثات، مثل حطام جدار الخلية أو الدهون في الشوائب. بعد الطرد المركزي، نقل سوبرنانت إلى كوب زجاجي، والتخلص من بيليه. لتعجيل البوليمر، إضافة اثنين من وحدات التخزين من 96٪ الإيثانول إلى ناظر، واحتضان التعليق في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بالنسبة للكميات الصغيرة أو غير المرئية من البوليمر المُعجَّل، فإن جهاز الطرد المركزي في التعليق 13,000 مرة ز عند أربع درجات مئوية لمدة 25 دقيقة. تجاهل بلطف عظمى، وإعادة فرض بيليه في ملليلتر واحد إلى اثنين من المياه ذات الايونية. نقل تعليق مائي إلى قارورة.
لكميات مرئية، كميات كبيرة من البوليمر عجلت، وجمع البوليمر عجلت مع ملقط معدنية معقمة إلى قارورة. الضغط على البوليمر، والتخلص من الإيثانول الزائد. لتنفيذ عملية التجميل المعروفة باسم تجميد التجفيف، والحفاظ على قارورة مع البوليمر عجل في ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
lyophilize البوليمر لمدة 48 ساعة على الأقل. ثم، تخزين البوليمر المجفف في المجففات في درجة حرارة الغرفة حتى مزيد من الاستخدام. لتركيز المتوسطة، أولا زراعة البكتيريا الزرقاء في ظل الظروف القياسية.
مراقبة نمو البكتيريا الزرقاء باستخدام الإجراءات القياسية. ثم، الطرد المركزي الثقافات في 4،000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. نقل فائقة إلى قارورة، والتخلص من بيليه الخلية.
بعد ذلك، قم بتصفية الوسيطة المُصفّدة من خلال مُصفّي حجم المسام 0.2 ميكرون. لتركيز المتوسط حوالي 500 مرة، استخدم المكثفات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي الاسمي من ثلاثة كيلودالون إلى جهاز الطرد المركزي 4، 000 مرات ز و 15 درجة مئوية لمدة أقصاها ساعة واحدة في جولة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، شطف جدران خزان عينة جهاز التصفية مع العينة المركزة، ونقل المحتوى إلى أنبوب microcentrifuge.
قم بإجراء خطوة إضافية للغسيل في خزان عينة جهاز التصفية باستخدام الوسيطة الخاصة بالثقافة ذات التكفاميد لضمان استرداد إكستروتيم أقصى. ثم، تخزين عينات exoproteome في ناقص 20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الإيثانول يجب أن يضاف بقوة لتحسين البوليمر هطول الأمطار والعائد.
بعد الطرد المركزي للبوليمر المُعجل، ينبغي أن يتم التخلص من المُبالغ المُبالغ بعناية من أجل تجنب إعادة الارحام في البيليه التي قد تكون مُلصقة بشكل فضفاض على جدار القارورة. إذا تم إجراء الترشيح اليدوي، يجب أن يكون لطيفًا لتجنب كسر غشاء التصفية. بعض البوليمرات التي عجلت يمكن أن تكون مرئية إلا بعد الطرد المركزي، وأساسا على جدران القارورة، مثل حالة EPS من Synechocystis.
في حالات أخرى، مثل البوليمر Cyanothece، فمن الممكن أن نرى كتل البوليمر العائمة في كوب الزجاج بعد هطول الأمطار. يمكن بسهولة الكشف عن بعض التلوث العيانية بعد البوليمر الlyophilization لأنها سوف تغير تصبغ البوليمر، وعادة بيضاء أو البني الفاتح. البوليمرات البرتقالية ملوثة بالكاروتينات أو الهياكل التي تحتوي على هذه الأصباغ.
فعلى سبيل المثال، تكون البوليمرات الخضراء ملوثة بحطام الخلايا والكلورو. يمكن أن تختلف إكستريتيوم بشكل كبير اعتمادا على سلالة بكتيرية. انظر، على سبيل المثال، exoproteome من البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية واحد من سلالة خيوطية.
يمكن أن تعوق الكمية العالية من السكريات في العينات المركزة exoproteome تحليل اكسوبروتيوم. على سبيل المثال، يمكن أن يؤخر فصل البروتين وقناع البروتينات أقل وفرة. يمكن للمستخدم تحديد خصائص البوليمر من حيث التركيب ، والخصائص الفيزيائية / الكيميائية ، واختبار النشاط البيولوجي البوليمر ، أو مكونات البوليمر المعدلة.
لتحديد البروتين، يمكن إجراء فصل البروتينات في هلام وقياس الطيف الشامل. و لفصل من vesicles، وينبغي تنفيذ الطرد فائقة المركزية من exoproteome. في مجموعتنا، مهدت هذه البروتوكولات بالفعل الطريق لكشف آليات إفراز البكتيريا الزرقاء أو تطبيقات البوليمرات الكربوهيدرات خارج الخلية في مجالات مختلفة، مثل في العلاج الحيوي أو كعوامل أنتيتومور أو توصيل المخدرات.
