Esses protocolos que desenvolvemos são importantes para estudar os mecanismos de secreção em cianobactérias e seus produtos liberados, ou seja, os polímeros e proteínas de carboidratos extracelulares. O conhecimento gerado nos permitirá personalizar esses produtos para diversas aplicações, ou seja, aplicações biotecnológicas e biomédicas. Esses protocolos são muito simples.
Eles podem ser adaptados de acordo com o organismo produtor, as necessidades do usuário e a aplicação final do produto. A principal vantagem desses protocolos é que eles podem ser facilmente adaptados a outros sistemas vivos, em particular a outras bactérias. Esses protocolos são fáceis.
No entanto, pode-se precisar introduzir algumas alterações dependendo da cepa bacteriana ou do grau de pureza necessário. Para começar, cultive a cepa cianobacteriana em condições normais. Medir o crescimento usando protocolos padrão.
Em seguida, transfira a cultura para membranas de diálise, e diálise contra um mínimo de 10 volumes de água deionizada por 24 horas com agitação contínua. Centrifugar a cultura a 15.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o supernatante para um novo frasco, e descarte a pelota.
Centrífuga novamente a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos para remover contaminantes, como detritos de parede celular ou lipopólises. Após a centrifugação, transfira o supernatante para um béquer de vidro, e descarte a pelota. Para precipitar o polímero, adicione dois volumes de 96% de etanol ao supernascido e incuba a suspensão a quatro graus Celsius durante a noite.
Para pequenas ou não quantidades visíveis de polímero precipitado, centrifugar a suspensão a 13.000 vezes g a quatro graus Celsius por 25 minutos. Descarte suavemente o supernasciente, e resuspenque a pelota em um a dois mililitros de água deionizada autoclavada. Transfira a suspensão aquosa para um frasco.
Para visível, grandes quantidades de polímero precipitado, colete o polímero precipitado com fórceps metálicos estéreis em um frasco. Aperte o polímero e descarte o excesso de etanol. Para realizar o processo de liofilização também conhecido como secagem congelante, mantenha os frascos com o polímero precipitado a menos 80 graus Celsius durante a noite.
Lyophilize o polímero por pelo menos 48 horas. Em seguida, armazene o polímero seco em um desiccador à temperatura ambiente até usar ainda mais. Para concentrar o meio, primeiro cultivar cianobactérias em condições padrão.
Monitore o crescimento do cianobacterium usando procedimentos padrão. Em seguida, centrifugar as culturas a 4.000 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o supernatante para um frasco, e descarte a pelota celular.
Em seguida, filtre o meio decantado através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 mícrons. Para concentrar o meio aproximadamente 500 vezes, use concentradores centrífugas com um corte nominal de peso molecular de três kilodaltons para centrífugas 4.000 vezes g e 15 graus Celsius para um máximo de uma hora por rodada de centorifugação. Após a centrifugação, enxágue as paredes do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com a amostra concentrada e transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifutura.
Realize uma etapa adicional de lavagem do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com o meio de cultura autoclaved para garantir a recuperação máxima do exoproteome. Em seguida, armazene as amostras de exoproteome a menos 20 graus Celsius até usar mais. O etanol deve ser adicionado vigorosamente para otimizar a precipitação e o rendimento do polímero.
Após a centrifugação do polímero precipitado, o descarte do supernante deve ser feito cuidadosamente para evitar a ressuspensão da pelota que pode ser vagamente presa na parede do frasco. Se a filtragem manual for realizada, deve ser suave para evitar quebrar a membrana do filtro. Alguns polímeros precipitados só podem ser visíveis após a centrifugação, principalmente nas paredes dos frascos, como o caso de EPS de Synechocystis.
Em outros casos, como o polímero Cyanothece, é possível ver os aglomerados de polímeros flutuando no béquer de vidro logo após a precipitação. Algumas contaminações podem ser facilmente detectadas macroscopicamente após a liofilização do polímero, pois alteram a pigmentação do polímero, geralmente branco ou marrom claro. Polímeros laranjas estão contaminados com carotenoides ou estruturas contendo esses pigmentos.
Por exemplo, polímeros verdes estão contaminados com detritos celulares e clorofila. Exoproteomes podem variar significativamente dependendo da cepa bacteriana. Veja, por exemplo, o exoproteome de um cianobacterium unicelular e o de uma cepa fiomante.
A alta quantidade de polissacarídeos em amostras exoprotetoras concentradas pode dificultar a análise exoproteome. Por exemplo, pode atrasar a separação de proteínas e mascarar proteínas menos abundantes. O usuário pode caracterizar o polímero em termos de composição, propriedades físicas/químicas, atividade biológica de polímero de teste ou componentes de polímeros modificados.
Para identificação de proteínas, pode ser realizada a separação de proteínas em gel e espectrometria de massa. E para a separação das vesículas, a ultracentrifugação do exoproteome deve ser realizada. Em nosso grupo, esses protocolos já abriram caminho para desvendar mecanismos de secreção cianobacteriana ou aplicações dos polímeros de carboidratos extracelulares em diferentes campos, como na bioremediação ou como agentes de antitumor ou de entrega de medicamentos.
