Эти протоколы, которые мы разработали, важны для изучения механизмов секреции в цианобактериях и их выпущенных продуктах, а именно внеклеточных углеводных полимеров и белков. Полученные знания позволят нам настроить эти продукты для нескольких приложений, а именно биотехнологических и биомедицинских приложений. Эти протоколы очень просты.
Они могут быть адаптированы в соответствии с организмом-производителем, потребностями пользователя и окончательным применением продукта. Основным преимуществом этих протоколов является то, что они могут быть легко адаптированы к другим живым системам, в частности к другим бактериям. Эти протоколы просты.
Тем не менее, возможно, потребуется ввести некоторые изменения в зависимости от бактериального штамма или степень чистоты требуется. Для начала возделывите цианобактериальный штамм в стандартных условиях. Измерьте рост с помощью стандартных протоколов.
Затем перенесите культуру в диализные мембраны и облизойте как минимум 10 томов деионизированной воды в течение 24 часов с непрерывным перемешиванием. Центрифуга культуры при 15 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Перенесите супернатант на новый флакон и отбросьте гранулы.
Центрифуга снова при 20 000 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут для удаления загрязняющих веществ, таких как клеточный стенок мусора или липополисахариды. После центрифугации перенесите супернатант в стеклянный стакан и отбросьте гранулы. Чтобы вызвать полимер, добавьте два тома 96% этанола к супернатанту и инкубировать суспензию при четырех градусах Цельсия за ночь.
Для небольших или не видимых количеств осажденного полимера центрифуга суспензии при 13 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 25 минут. Аккуратно отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в один-два миллилитра автоматической деионизированной воды. Перенесите аквеозную подвеску на флакон.
Для видимых, большое количество осажденного полимера, собирать осажденный полимер со стерильными металлическими типсами на флакон. Сожмите полимер, и отказаться от избыточного этанола. Для выполнения процесса лиофилизации иначе известный как замораживание сушки, держать флаконы с осажденным полимером при температуре минус 80 градусов по Цельсию на ночь.
Лиофилизировать полимер, по крайней мере 48 часов. Затем храните высушенный полимер в децикаторе при комнатной температуре до дальнейшего использования. Чтобы сконцентрировать среду, сначала культивируйте цианобактерии в стандартных условиях.
Мониторинг роста цианобактерий с помощью стандартных процедур. Затем центрифуга культур в 4000 раз г при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесите супернатант в колбу и выбросьте клеточные гранулы.
Затем отфильтруй декантированную среду через фильтр размером 0,2 микрона. Чтобы сконцентрировать среду примерно в 500 раз, используйте центробежные концентраторы с номинальным молекулярным весом, разрезанным на три килодалтона, чтобы центрифуга в 4 000 раз g и 15 градусов по Цельсию в течение максимум одного часа центрифугации раунда. После центрифугации промыть стенки фильтровальной устройства образцом резервуара с концентрированным образцом, а содержимое перенести в микроцентрифугную трубку.
Выполните дополнительный шаг мытья резервуара образца фильтра с автоматической средой культуры для обеспечения максимального восстановления экзопротеома. Затем храните образцы экзопротеом при температуре минус 20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. Этанол необходимо энергично добавить для оптимизации полимерных осадков и урожайности.
После центрифугирования осажденного полимера следует тщательно сделать выброс супернатанта, чтобы избежать повторного незаменимости гранул, которые могут быть слабо прикреплены к стене колбы. Если ручная фильтрация выполняется, она должна быть мягкой, чтобы избежать нарушения мембраны фильтра. Некоторые осажденные полимеры могут быть видны только после центрифугации, в основном на стенах колб, таких как случай ЭПС от Synechocystis.
В других случаях, таких как полимер Cyanothece, можно увидеть полимерные сгустки, плавающие в стеклянном стакане сразу после осадков. Некоторые загрязнения могут быть легко обнаружены макроскопически после лиофилизации полимера, поскольку они изменят пигментацию полимера, как правило, белый или светло-коричневый. Оранжевые полимеры загрязнены каротиноидами или структурами, содержащими эти пигменты.
Например, зеленые полимеры загрязнены клеточным мусором и хлорофиллом. Экзопротеомы могут значительно варьироваться в зависимости от бактериального штамма. См., например, экзопротеом из одноклеточного цианобактерия и один из нити штамма.
Большое количество полисахаридов в экзопротеомно-концентрированных образцах может препятствовать анализу экзопротеомы. Например, он может задержать разделение белка и маскировать менее обильные белки. Пользователь может охарактеризовать полимер с точки зрения состава, физических/химических свойств, тестовой полимерной биологической активности или модифицированных полимерных компонентов.
Для идентификации белка может быть выполнено разделение белков на гель и масс-спектрометрию. А для разделения пузырьков следует проводить ультрацентрифугирование экзопротеомы. В нашей группе эти протоколы уже проложили путь к распутыванию цианобактериальных механизмов секреции или применения внеклеточных углеводных полимеров в различных областях, таких как биовосстановление или в качестве противоопухолевых или лекарственных средств.
