Diese Protokolle, die wir entwickelt haben, sind wichtig, um die Sekretionsmechanismen in Cyanobakterien und deren freigesetzten Produkten zu untersuchen, nämlich die extrazellulären Kohlenhydratpolymere und Proteine. Das gewonnene Wissen wird es uns ermöglichen, diese Produkte für verschiedene Anwendungen anzupassen, nämlich für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Diese Protokolle sind sehr einfach.
Sie können auf den produzierenden Organismus, die Bedürfnisse des Anwenders und die endgültige Anwendung des Produkts zugeschnitten werden. Der Hauptvorteil dieser Protokolle besteht darin, dass sie leicht an andere lebende Systeme, insbesondere an andere Bakterien, angepasst werden können. Diese Protokolle sind einfach.
Allerdings kann es sein, dass man einige Änderungen in Abhängigkeit von der bakteriellen Belastung oder dem erforderlichen Reinheitsgrad vornehmen muss. Zunächst kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen. Messen Sie das Wachstum mithilfe von Standardprotokollen.
Als nächstes übertragen Sie die Kultur in Dialysemembranen, und dialysieren gegen mindestens 10 Volumen von entionisiertem Wasser für 24 Stunden mit kontinuierlichem Rühren. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 15.000 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Den Überstand in eine neue Durchstechflasche geben und das Pellet entsorgen.
Zentrifugieren Sie wieder bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um Verunreinigungen wie Zellwandablagerungen oder Lipopolysaccharide zu entfernen. Nach der Zentrifugation den Überstand in ein Glasbecher geben und das Pellet entsorgen. Um das Polymer auszufällen, fügen Sie dem Überstand zwei Volumina von 96% Ethanol hinzu und inkubieren Sie die Suspension bei vier Grad Celsius über Nacht.
Zentrifugieren Sie bei kleinen oder nicht sichtbaren Mengen niederschlagsmittelem Polymer die Suspension bei 13.000 mal g bei vier Grad Celsius für 25 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Pellet in ein bis zwei Milliliter autoklaviertem entionisiertem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die wässrige Aufhängung auf eine Durchstechflasche.
Für sichtbare, große Mengen von gefälltem Polymer, sammeln Sie das gefällte Polymer mit sterilen Metallzangen zu einer Durchstechflasche. Drücken Sie das Polymer, und entsorgen Sie das überschüssige Ethanol. Um den Lyophilisierungsprozess durchzuführen, der auch als Gefriertrocknung bekannt ist, halten Sie die Fläschchen mit dem gefällten Polymer über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.
Lyophilisieren Sie das Polymer für mindestens 48 Stunden. Dann das getrocknete Polymer in einem Trockenschrank bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung aufbewahren. Um das Medium zu konzentrieren, kultivieren Sie zunächst Cyanobakterien unter Standardbedingungen.
Überwachen Sie das Cyanobacterium-Wachstum mit Standardverfahren. Dann zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4.000 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand in einen Kolben, und entsorgen Sie das Zellpellet.
Filtern Sie anschließend das dekantierte Medium durch einen 0,2-Mikron-Poren-Filter. Um das Medium etwa 500 Mal zu konzentrieren, verwenden Sie Zentrifugalkonzentratoren mit einer nominalen Molekulargewichtsabschaltung von drei Kilodaltonen zur Zentrifuge 4.000 mal g und 15 Grad Celsius für maximal eine Stunde pro Zentrifugation. Nach der Zentrifugation die Wände des Filtergeräteprobenreservoirs mit der konzentrierten Probe abspülen und den Inhalt in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt des Filtergeräte-Probenreservoirs mit dem autoklavierten Kulturmedium durch, um eine maximale Exoproteom-Wiederherstellung zu gewährleisten. Dann lagern Sie die Exoproteom-Proben bei minus 20 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Das Ethanol muss kräftig zugesetzt werden, um die Polymerausfällung und Ausbeute zu optimieren.
Nach der Zentrifugierung des gefällten Polymers sollte der Rückwurf des Überstandes sorgfältig erfolgen, um eine erneute Aufhängung des Pellets zu vermeiden, das lose an der Kolbenwand befestigt werden kann. Wenn eine manuelle Filtration durchgeführt wird, sollte es schonend sein, um ein Bruch der Filtermembran zu vermeiden. Einige gefällte Polymere können nur nach der Zentrifugation sichtbar sein, hauptsächlich an den Wänden der Kolben, wie im Fall von EPS von Synechocystis.
In anderen Fällen, wie Cyanothece Polymer, ist es möglich, die Polymerklumpen im Glasbecher kurz nach dem Niederschlag schwimmen zu sehen. Einige Verunreinigungen können nach der Polymerlyophilisierung makroskopisch leicht erkannt werden, da sie die Polymerpigmentierung verändern, in der Regel weiß oder hellbraun. Orange Polymere sind mit Carotinoiden oder Strukturen kontaminiert, die diese Pigmente enthalten.
Beispielsweise sind grüne Polymere mit Zellablagerungen und Chlorophyll kontaminiert. Exoproteome können je nach Bakterienstamm erheblich variieren. Siehe z. B. das Exoproteom aus einem einzelligen Cyanobakterium und das aus einem fadenförmigen Stamm.
Die hohe Menge an Polysacchariden in Exoproteom-konzentrierten Proben kann die Exoproteom-Analyse behindern. Zum Beispiel kann es die Proteintrennung verzögern und weniger reichlich eiterne Proteine maskieren. Der Anwender kann das Polymer in Bezug auf Zusammensetzung, physikalische/chemische Eigenschaften, biologische Aktivität des Prüfpolymers oder modifizierte Polymerkomponenten charakterisieren.
Zur Proteinidentifikation kann die Trennung von Proteinen in der Gel- und Massenspektrometrie durchgeführt werden. Und zur Trennung der Vesikel sollte eine Ultrazentrifugation des Exoproteoms durchgeführt werden. In unserer Gruppe haben diese Protokolle bereits den Weg geebnet, cyanobakterielle Sekretionsmechanismen oder Anwendungen der extrazellulären Kohlenhydratpolymere in verschiedenen Bereichen zu entwirren, z. B. in der Biosanierung oder als Antitumor- oder Arzneimittelabgabemittel.
