我々が開発したこれらのプロトコルは、シアノバクテリアとその放出産物、すなわち細胞外炭水化物ポリマーおよびタンパク質の分泌メカニズムを研究するために重要である。生成された知識は、我々はいくつかのアプリケーション、すなわちバイオテクノロジーとバイオメディカルアプリケーションのためにこれらの製品をカスタマイズすることができます。これらのプロトコルは非常に簡単です。
それらは生産生物、ユーザーの必要性、およびプロダクトの最終的な適用に従って合わせることができる。これらのプロトコルの主な利点は、他の生物系、特に他の細菌に容易に適応できることである。これらのプロトコルは簡単です。
しかし、細菌株または必要な純度に応じて、いくつかの変化を導入する必要があるかもしれません。まず、シアノバクテリア株を標準的な条件下で栽培する。標準プロトコルを使用して成長を測定します。
次に、培養液を透析膜に移し、連続撹拌しながら24時間、最低10容量の脱イオン水に対して透析を行う。摂氏4度で15,000倍gの培養物を15分間遠心する。上清を新しいバイアルに移し、ペレットを捨てます。
遠心分離機は、細胞壁の破片またはリポ多糖類などの汚染物質を除去するために、摂氏4度で20,000倍のgで再び15分間行った。遠心分離後、上清をガラスビーカーに移し、ペレットを捨てる。ポリマーを沈殿させるために、上清に96%エタノールの2つのボリュームを加え、一晩摂氏4度で懸濁液をインキュベートする。
沈殿ポリマーの少量または目に見えない量の場合、25分間摂氏4度で13,000倍gの懸濁液を遠心分離する。上清を静かに捨て、ペレットをオートクレーブ脱イオン水の1~2ミリリットルで再懸濁する。水性懸濁液をバイアルに移します。
目に見える、大量の沈殿ポリマーについては、滅菌金属鉗子を介して沈殿させたポリマーをバイアルに集める。ポリマーを絞り、余分なエタノールを捨てる。凍結乾燥と呼ばれる凍結乾燥プロセスを実行するには、沈殿したポリマーを一晩マイナス80度に保ちます。
ポリマーを少なくとも48時間凍結乾燥する。次いで、乾燥したポリマーを、さらに使用するまで室温でデシケータに保管する。培地を濃縮するために、まず、標準的な条件下でシアノバクテリアを栽培する。
シアノバクテリウムの成長を標準的な手順で監視します。次いで、室温で4,000倍gの培養物を10分間遠心する。上清をフラスコに移し、細胞ペレットを捨てる。
次に、0.2ミクロンの細孔サイズフィルターを介してデカン化された培地をフィルター処理します。培地を約500倍に濃縮するには、3キロダルトンから遠心分離器4、000倍g、摂氏15度の公称分子量カットオフを有する遠心濃縮器を、1回の遠心分離ラウンドあたり最大1時間使用する。遠心分離後、フィルター装置サンプルリザーバーの壁を濃縮サンプルでリンスし、その内容をマイクロ遠心チューブに移します。
オートクレーブ培養培地を用いてフィルター装置サンプルリザーバの追加洗浄工程を行い、最大エキソプロテオーム回収を確実に行う。次に、エキソプロテオームサンプルをマイナス20°Cで保存し、さらに使用するまで保管します。エタノールは、ポリマー沈殿と収率を最適化するために精力的に添加する必要があります。
沈殿したポリマーを遠心分離した後、上清の廃棄は、フラスコの壁に緩やかに付着し得るペレットの再懸濁を避けるために慎重に行われるべきである。手動でろ過を行う場合は、フィルター膜を壊さないように優しくする必要があります。沈殿したポリマーの中には、主にシネコシスティスのEPSの場合など、フラスコの壁部に比べ、遠心分離後にのみ見ることができるものがあります。
他の場合には、シアノテーゼポリマーのような、沈殿直後にガラスビーカーに浮遊するポリマー塊を見ることができる。ポリマーの色素沈着(通常は白色または薄茶色)を変えるので、一部の汚染は、ポリマー凍結乾燥後にマクロ的に容易に検出することができる。オレンジ色のポリマーは、カロテノイドまたはこれらの顔料を含む構造で汚染されています。
例えば、緑色のポリマーは、細胞の破片およびクロロフィルで汚染される。エキソプロテオームは、細菌株によって大きく異なる場合があります。例えば、単細胞シアノバクテリウムからのエキソプロテオームと糸状株からのエキソプロテオームを参照してください。
エキソプロテオーム濃縮サンプル中の多糖類の多量は、エキソプロテオーム分析を妨げる可能性があります。例えば、タンパク質の分離を遅らせ、タンパク質のマスクを少なくすることができます。ユーザーは、組成物、物理的/化学的特性、試験ポリマー生物学的活性、または改変ポリマー成分の観点からポリマーを特徴付けることができます。
タンパク質同定のために、ゲルおよび質量分析におけるタンパク質の分離を行うことができる。そして、小胞の分離のために、エキソプロテオームの超遠心分離を行う必要があります。我々のグループでは、これらのプロトコルは、バイオレメディエーションや抗腫瘍剤または薬物送達剤など、異なる分野におけるシアノバクテリア分泌機構または細胞外炭水化物ポリマーの応用を解明する道を既に開いている。
