Estos protocolos que desarrollamos son importantes para estudiar los mecanismos de secreción en cianobacterias y sus productos liberados, a saber, los polímeros y proteínas de carbohidratos extracelulares. El conocimiento generado nos permitirá personalizar estos productos para diversas aplicaciones, a saber, aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Estos protocolos son muy sencillos.
Se pueden adaptar según el organismo productor, las necesidades del usuario y la aplicación final del producto. La principal ventaja de estos protocolos es que se pueden adaptar fácilmente a otros sistemas vivos, en particular a otras bacterias. Estos protocolos son fáciles.
Sin embargo, uno puede necesitar introducir algunos cambios dependiendo de la cepa bacteriana o el grado de pureza requerida. Para empezar, cultivar la cepa cianobacteriana en condiciones estándar. Mida el crecimiento utilizando protocolos estándar.
A continuación, transfiera el cultivo a membranas de diálisis y dialice contra un mínimo de 10 volúmenes de agua desionizada durante 24 horas con agitación continua. Centrifugar el cultivo a 15.000 g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera el sobrenadante a un vial nuevo y deseche el pellet.
Centrifugar de nuevo a 20.000 veces g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos para eliminar contaminantes, como restos de pared celular o lipopolisacáridos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un vaso de precipitados de vidrio y deseche el pellet. Para precipitar el polímero, añadir dos volúmenes de 96% etanol al sobrenadante, e incubar la suspensión a cuatro grados Celsius durante la noche.
Para pequeñas o no visibles cantidades de polímero precipitado, centrifugar la suspensión a 13.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 25 minutos. Deseche suavemente el sobrenadante y resuspender el pellet en uno o dos mililitros de agua desionizada autoclavizada. Transfiera la suspensión acuosa a un vial.
Para grandes cantidades visibles de polímero precipitado, recoja el polímero precipitado con fórceps metálicos estériles en un vial. Apriete el polímero y deseche el exceso de etanol. Para realizar el proceso de liofilización también conocido como secado por congelación, mantenga los viales con el polímero precipitado a menos 80 grados centígrados durante la noche.
Liofilizar el polímero durante al menos 48 horas. A continuación, guarde el polímero seco en un desecador a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Para concentrar el medio, primero cultivar cianobacterias en condiciones estándar.
Monitorear el crecimiento de cianobacterium utilizando procedimientos estándar. Luego, centrifugar los cultivos a 4.000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un matraz y deseche el pellet celular.
A continuación, filtre el medio decantado a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 micras. Para concentrar el medio aproximadamente 500 veces, utilice concentradores centrífugos con un corte de peso molecular nominal de tres kilodatones para centrifugar 4.000 veces g y 15 grados celsius durante un máximo de una hora por centrifugación redonda. Después de la centrifugación, enjuague las paredes del depósito de muestra del dispositivo de filtro con la muestra concentrada y transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga.
Realice un paso de lavado adicional del depósito de muestra del dispositivo de filtro con el medio de cultivo autoclavedo para garantizar la máxima recuperación del exoprotemo. A continuación, guarde las muestras de exoproteomo a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. El etanol debe añadirse vigorosamente para optimizar la precipitación y el rendimiento del polímero.
Después de centrifugar el polímero precipitado, el descarte del sobrenadante debe hacerse cuidadosamente para evitar la resuspensión del pellet que puede estar libremente unido en la pared del matraz. Si se realiza una filtración manual, debe ser suave para evitar romper la membrana del filtro. Algunos polímeros precipitados sólo pueden ser visibles después de la centrifugación, principalmente en las paredes de los matraces, como el caso de EPS de Synechocystis.
En otros casos, como el polímero Cyanothece, es posible ver los grumos de polímero flotando en el vaso de precipitados de vidrio justo después de la precipitación. Algunas contaminaciones se pueden detectar fácilmente macroscópicamente después de la liofilización de polímeros, ya que alterarán la pigmentación del polímero, generalmente blanco o marrón claro. Los polímeros naranjas están contaminados con carotenoides o estructuras que contienen estos pigmentos.
Por ejemplo, los polímeros verdes están contaminados con desechos celulares y clorofila. Los exoprotemos pueden variar significativamente dependiendo de la cepa bacteriana. Véase, por ejemplo, el exoprotemo de un cianobacterium unicelular y el de una cepa filamentosa.
La alta cantidad de polisacáridos en muestras concentradas con exoproteomo puede obstaculizar el análisis del exoproteoma. Por ejemplo, puede retrasar la separación de proteínas y enmascarar proteínas menos abundantes. El usuario puede caracterizar el polímero en términos de composición, propiedades físicas/químicas, actividad biológica de polímero de prueba o componentes de polímero modificados.
Para la identificación de proteínas, se puede realizar la separación de proteínas en gel y espectrometría de masas. Y para la separación de las vesículas, se debe realizar la ultracentrifugación del exoprotemo. En nuestro grupo, estos protocolos ya han allanado el camino para desentrañar mecanismos de secreción cianobacteriana o aplicaciones de los polímeros de carbohidratos extracelulares en diferentes campos, como en la biorremediación o como antitumoores o agentes de administración de fármacos.
