分化肝细胞中的血管性脂细胞病的诱导和特征

该协议描述了如何诱导肝体在分化的肝细胞中节生病，以及检测和定量脂质积累的方法。这种体外人类细胞模型是体内小鼠模型和原发人类肝细胞的宝贵替代品。将一批低通的 HepaRG 细胞浸入 37 摄氏度的浴缸中，直到解冻，将氮低温保存。

快速转移细胞到含有10毫升增殖介质的15毫升管中。离心五分钟后，丢弃上经剂，将细胞重新在增殖介质的五毫升中。数数细胞并稀释，以便每平方厘米镀25万个细胞。

将细胞板在100毫米细胞培养皿上，每两三天更新一次培养。细胞以大约24小时加倍的时间增殖。一旦 HepaRG 细胞达到 80% 的汇合，通过 3 到 5 分钟的孵育与 0.05% 的 trypsin 溶液分离它们。

收集增殖介质中的细胞，并像以前一样在离心机中收集五分钟。丢弃上一代，用五毫升增殖介质重新暂停细胞。再次，计算细胞和稀释，以板25万细胞每平方厘米。

在此阶段，通过重复这些步骤来放大细胞，以达到适当数量的细胞开始实验。要冷冻保存肝素细胞，在电镀后24小时分离细胞，用0.05%的三辛精溶液进行三到五分钟的孵育。收集增殖介质中的细胞，并像以前一样在离心机中收集五分钟。

丢弃上清液，将细胞重新用每批冷冻介质一毫升，冷冻保存液氮。在第零天，种子肝细胞以每平方厘米25万细胞进入培养处理的培养皿与适当的增殖介质量。每个测定需要镀两个盘子，一个用于控制细胞，一个用于油酸盐处理细胞。

第二天和第四天，用适当的增殖介质体积改变介质，让细胞生长，直到它们达到汇合。第七天，细胞必须100%汇合。用1X PBS清洗细胞一次。

然后，删除 1X PBS 并添加适当的分型介质体积。第8天、第9天、第12天、第15天和18天，用1X PBS清洗细胞一次，然后加入适当的分型介质。第21天，在显微镜下观察肝细胞，确保细胞是分汇分化培养物。

作为一种对照，收获一个控制盘，对分化标记基因进行基因表达分析。在第21天，分化的肝细胞可以冷冻在液氮中。第21天，用适当体积的完整分化介质稀释油酸钠，最终浓度为250微摩尔。

以 1 比 400 的比例将 99% 甲醇加入另一种分色介质中，进行车辆控制处理。用1X PBS清洗细胞一次，并加入车辆或油酸钠介质。第 23 天和第 25 天，使用适当体积的新鲜准备介质更换介质。

在第26天，通过光学显微镜观察细胞。脂质液滴积聚在钠油化处理细胞中，在细胞质中很容易看到为半透明液滴。要进行油红 O 染色，首先用 1X PBS 清洗细胞一次，然后完全取出 1X PBS。

加入4%的甲醛，在室温下孵育15分钟。去除甲醛，用1X PBS清洗细胞两次。取出PBS后，在室温下用60%异丙醇孵育细胞5分钟。

取出异丙醇，让细胞在室温下完全干燥。现在向细胞中加入油红O工作溶液，在室温下孵育30分钟。每个样品所需的工作溶液量对应于用于培养细胞的介质量。

拆下油红 O 溶液，立即加入双蒸馏水。用双蒸馏水洗四次细胞后，在显微镜下获取图像进行分析。要洗洗油红O染料，去除所有的水，并允许干燥。

然后，加入100%异丙醇的毫升，在室温下轻轻摇动10分钟。用洗出的油红O染料上下移液，确保所有油红O在溶液中。将解决方案转移到库梅特。

通过分光光度测量测量500纳米的光学密度，使用100%等丙醇作为空白。用1X PBS清洗细胞一次。然后，在37摄氏度的黑暗中，用100纳米摩尔的Bodipy在1XPBS中稀释40分钟。

流量细胞测量中应包含未污染的控件。去除染色溶液，用1X PBS清洗细胞一次。然后，再次清洗细胞，并完全取出PBS。

加入4%的甲醛，在室温下孵育15分钟。去除甲醛，在PBS中清洗样品三次，洗涤五分钟。细胞可以保存在4摄氏度的1XPBS中，或立即进行成像。

对于存储，用 Parafilm 包装，用铝箔盖住，以防止细胞干燥。为了验证有效诱导的硬化，油酸盐处理和控制肝细胞染色油红O染料。染色后，脂质液滴很容易像红色液滴一样可见。

通过用异丙醇洗洗的油R O染料的分光光度测量，可以进行染色。从细胞中吸收洗出的油红O与细胞质脂液滴积累成正比。盐酸钠浓度和暴露时间由MTT色度细胞可行性测定确定。

Formosan 产品在 490 纳米的吸光度中进行量化，与培养中的活细胞数量成正比。将油酸钠治疗与棕榈酸钠治疗进行比较。凋亡药物多索鲁比辛被用作控制。

为了量化钠油处理后细胞脂质含量的增加，使用Bodipy染料染色，用于标记脂质液滴。利用细胞荧光分析，可以量化甘油三酯含量的Bodipy平均荧光强度，与控制细胞相比，在油酸盐处理的细胞中，甘油三酯含量更高。这表明油酸盐治疗后脂肪积累是有效的。

事实上，Bodipy染色细胞的图像显示，在经过油酸盐处理的细胞中，明亮的绿色荧光脂液滴在控制细胞中不可见。为了进一步描述脂液液滴在钠油处理后积累，CARS显微镜可以执行如文本协议中描述的，使脂质液滴定量，而无需贴标签。这种基于细胞的模型可以增加对非肿瘤脂肪肝疾病的分子机制的了解，并可能导致早期诊断和新的治疗策略的新标记物的发展。