Este protocolo describe cómo inducir la esteatosis vesicular hepática en células HepaRG diferenciadas y métodos para la detección y cuantificación de la acumulación de lípidos. Este modelo de células humanas in vitro representa una alternativa valiosa a los modelos de ratones in vivo y a los hepatocitos humanos primarios. Descongelar un lote crioconservado de nitrógeno de células de paso bajo de células HepaRG sumergiéndolas en un baño de 37 grados Celsius hasta que se descongelaron.
Transfiera rápidamente las células a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio proliferante. Después de centrifugar durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y resuspend las células en cinco mililitros de medio proliferante. Contar las células y diluir con el fin de platear 250.000 células por centímetro cuadrado.
Plato de las células en platos de cultivo celular de 100 milímetros y renovar el medio cada dos o tres días. Las células proliferan con un tiempo de duplicación de alrededor de 24 horas. Una vez que las células HepaRG alcanzan el 80% de confluencia, desprendedlas a través de una incubación de tres a cinco minutos con una solución de 0,05% de trippsina.
Recoger las células en medio proliferador y centrifugar durante cinco minutos como antes. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con cinco mililitros de medio proliferante. Una vez más, contar las células y diluir con el fin de platear 250.000 células por centímetro cuadrado.
En esta etapa, amplificar las células repitiendo estos pasos para alcanzar un número adecuado de células para iniciar experimentos. Para criopreservar las células hepaRG, desprenda las células 24 horas después del enchapado a través de una incubación de tres a cinco minutos con una solución de 0,05% de trippsina. Recoger las células en medio proliferador y centrifugar durante cinco minutos como antes.
Desechar el sobrenadante, resuspender las células en un mililitro por lote de medio de congelación y criopreservar los lotes en nitrógeno líquido. En el día cero, las células HepaRG de semillas a 250.000 células por centímetro cuadrado en platos tratados con cultivo con un volumen adecuado de medio de proliferación. Hay que planchar dos platos para cada ensayo, uno para las células de control y otro para las células tratadas con oleato.
En el día dos y cuarto, cambie el medio con un volumen adecuado de medio de proliferación y deje que las células crezcan hasta que alcancen la confluencia. En el séptimo día, las células deben ser 100%confluentes. Lave las células una vez con 1X PBS.
A continuación, retire el 1X PBS y agregue un volumen adecuado de medio de diferenciación. En los días ocho, nueve, 12, 15 y 18, lave las células una vez con 1X PBS antes de agregar un volumen adecuado de medio de diferenciación. En el día 21, observe las células HepaRG bajo un microscopio y asegúrese de que las células son cultivos diferenciados confluentes.
Como control, cosecha un plato de control para realizar análisis de expresión génica de genes marcadores de diferenciación. En el día 21, las células HepaRG diferenciadas se pueden crioconservarse en nitrógeno líquido. En el día 21, diluir el oleato sódico con un volumen adecuado de medio de diferenciación completa a una concentración final de 250 micromolares.
Añadir 99%metanol en una proporción de uno a 400 en otra alícuota de medio de diferenciación para hacer el tratamiento de control del vehículo. Lave las células una vez con 1X PBS y agregue el medio de oleato de vehículo o sodio. El día 23 y el día 25, cambie el medio con el volumen adecuado de medio recién preparado.
El día 26, observe las células por microscopía óptica. Las gotas de lípidos se acumulan en las células tratadas con oleato de sodio y son fácilmente visibles como gotas translúcidas en el citoplasma. Para realizar la tinción de Aceite Rojo O, primero lave las células una vez con 1X PBS y retire el 1X PBS completamente.
Añadir 4%paraformaldehído e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el paraformaldehído y lave las células dos veces con 1X PBS. Después de retirar el PBS, incubar las células con 60%isopropanol durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Retire el isopropanol y deje que las células se sequen completamente a temperatura ambiente. Ahora agregue la solución de trabajo Oil Red O a las células e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El volumen de solución de trabajo necesario para cada muestra corresponde al volumen de medios utilizados para el cultivo de las células.
Retire la solución Oil Red O y agregue inmediatamente agua doble destilada. Después de lavar las células cuatro veces con agua de doble destilación, adquiera imágenes bajo el microscopio para su análisis. Para elecer el tinte Oil Red O, retire toda el agua y deje secar.
Luego, agregue un mililitro de 100%isopropanol e incubar durante 10 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente. Pipetear el isopropanol con aceite eluido O tinte arriba y abajo varias veces, asegurando que todo el aceite rojo O está en la solución. Transfiera la solución a una cubeta.
Mida la densidad óptica a 500 nanómetros por espectrofotometría y utilice 100%isopropanol como blanco. Lave las células una vez con 1X PBS. Luego, incubar con 100 nanomolares de Bodipy diluidos en 1X PBS en la oscuridad durante 40 minutos a 37 grados Celsius.
Se debe incluir un control no manchado en las mediciones de citometría de flujo. Retire la solución de tinción y lave las células una vez con 1X PBS. Luego, lave las células de nuevo y retire el PBS por completo.
Añadir 4%paraformaldehído e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el paraformaldehído y lave las muestras tres veces durante cinco minutos en PBS. Las celdas se pueden mantener en 1X PBS a cuatro grados Celsius o se pueden obtener imágenes inmediatamente.
Para el almacenamiento, envuelva con Parafilm y cubra con papel de aluminio para evitar que las células se sequen. Para verificar la inducción eficiente de la esteatosis, las células hepatRnóricas tratadas con oleato y control se tiñeron con el tinte Oil Red O. Después de la tinción, las gotas de lípidos son fácilmente visibles como gotas rojas.
La tinción se puede cuantificar mediante la medición espectrofotométrica del tinte Oil R O eluido con isopropanol. La absorción del aceite eluido Rojo O de las células es directamente proporcional a la acumulación de gotas lipídicas citoplasmáticos. La concentración de oleato de sodio y el tiempo de exposición se determinaron mediante el ensayo de viabilidad celular colorimétrica MTT.
El producto Formosan se cuantifica por su absorbancia a 490 nanómetros y es directamente proporcional al número de células vivas en cultivo. El tratamiento con oleato de sodio se comparó con el tratamiento con palmitato de sodio. El fármaco apoptótico doxorubicina fue utilizado como un control.
Para cuantificar el aumento del contenido de lípidos celulares después del tratamiento con oleato de sodio, se utilizó la tinción con tinte Bodipy para etiquetar las gotas lipídicas. Utilizando el análisis citofluorométrico, es posible cuantificar el contenido de triglicéridos por intensidad fluorescente media de Bodipy, que es mayor en las células tratadas con oleato en comparación con las células de control. Esto indica una acumulación eficiente de grasa después del tratamiento con oleato.
De hecho, las imágenes de células teñidas de Bodipy muestran gotas de lípidos fluorescentes de color verde brillante en células tratadas con oleato que no son visibles en las células de control. Para caracterizar aún más la acumulación de gotas de lípidos después del tratamiento con oleato de sodio, la microscopía CARS se puede realizar como se describe en el protocolo de texto que permite la cuantificación de gotas lipídicas sin etiquetado. Este modelo basado en células puede aumentar el conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad del hígado graso no oncótico y podría conducir al desarrollo de nuevos marcadores para el diagnóstico temprano y nuevas estrategias de tratamiento.
