이 프로토콜은 분화 된 HepaRG 세포와 지질 축적의 검출 및 정량화를위한 방법에 간 성구 세포증을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 체외 인간 세포 모델은 생체 내 마우스 모델과 1 차적인 인간 간세포에 대한 귀중한 대안을 나타냅니다. 해동 될 때까지 37도 섭씨 욕조에 담그어 헤파RG 세포의 저통로 배치를 녹여 서 녹입니다.
확산 배지의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 세포를 급속하게 전송합니다. 5 분 동안 원심 분리 후, 상체를 버리고 확산 매체의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 세포를 계산하고 평방 센티미터 당 250, 000 세포를 플레이트하기 위해 희석하십시오.
세포를 100mm 세포 배양 접시에 접시에 접시를 매고 2 ~ 3 일마다 배지를 갱신하십시오. 세포는 약 24 시간의 두 배 시간으로 증식합니다. HepaRG 세포가 80%의 인플루엔자에 도달하면 0.05%의 트립신 용액으로 3-5분 간 배양을 통해 분리합니다.
이전과 같이 5 분 동안 증식 매체 및 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. 상체를 버리고 확산 매체의 5 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. 다시 말하지만, 세포를 계산하고 평방 센티미터 당 250, 000 세포를 플레이트하기 위해 희석하십시오.
이 단계에서는 이러한 단계를 반복하여 실험을 시작하기 위해 적절한 수의 세포에 도달하여 세포를 증폭시합니다. HepaRG 세포를 냉동 보존하려면 0.05 %의 트립신 용액으로 3 ~ 5 분 배양을 통해 도금 후 24 시간을 세포를 분리하십시오. 이전과 같이 5 분 동안 증식 매체 및 원심 분리기에서 세포를 수집합니다.
상체를 버리고, 동결 매체의 배치당 1 밀리리터로 세포를 재연하고, 액체 질소의 배치를 냉동 보존한다. 제로 일째에, 종자 HepaRG 세포에서 250, 평방 센티미터 당 000 세포는 확산 배지의 적당한 양량으로 배양 처리 된 접시로. 두 가지 요리는 각 분석체에 대해 도금되어야하며, 하나는 제어 셀용과 올레아테 처리 된 세포를 위해 하나.
둘째 날과 4일째에, 배지를 적절한 양의 증식 배지로 변경하고 결합에 도달할 때까지 세포가 성장하도록 합니다. 7일째에, 세포는 100% 혼잡해야 합니다. 1X PBS로 한 번 씻어내다.
그런 다음 1X PBS를 제거하고 적절한 분화 매체를 추가합니다. 8일, 9일, 12, 15일, 18일에는 1X PBS로 세포를 한 번 세척한 후 적절한 분화 배지를 첨가한다. 21일째에, 현미경의 밑에 HepaRG 세포를 관찰하고 세포가 분화된 배양물이다는 것을 확인하십시오.
대조군으로서, 분화 마커 유전자의 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 하나의 대조군 접시를 수확한다. 21일째에, 분화한 HepaRG 세포는 액체 질소에서 냉동 보존될 수 있다. 21일, 완전한 분화 배지의 적절한 부피로 올레아테를 희석하여 최종 농도250 마이크로몰라를 섭취한다.
차량 제어 처리를 만들기 위해 차별화 매체의 또 다른 알리쿼트에 1~400의 비율로 99%의 메탄올을 추가합니다. 1X PBS로 세포를 한 번 씻고 차량 또는 올레아테 나트륨 배지를 추가합니다. 23일일과 25일에는 갓 준비된 매체의 적절한 부피로 매체를 변경한다.
26일째에, 광학 현미경 검사법에 의해 세포를 관찰한다. 지질 방울은 올레아트 나트륨 처리 된 세포에 축적되고 세포질에서 반투명 방울로 쉽게 볼 수 있습니다. 오일 레드 O 염색을 수행하려면 먼저 1X PBS로 한 번 세포를 세척하고 1X PBS를 완전히 제거합니다.
4%의 파라포름알데히드를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 제거하고 1X PBS로 두 번 세척합니다. PBS를 제거한 후 실온에서 5분 동안 60%의 이소프로파놀로 세포를 배양합니다.
이소프로파놀을 제거하고 실온에서 세포가 완전히 건조하게 하십시오. 이제 오일 레드 O 작업 용액을 세포에 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 각 샘플에 필요한 작업 용액의 양은 세포를 배양하는 데 사용되는 미디어의 양에 해당합니다.
오일 레드 O 용액을 제거하고 즉시 이중 증류수를 추가합니다. 이중 증류수로 세포를 4번 세척한 후 현미경으로 이미지를 획득하여 분석을 수행합니다. 오일 레드 O 염료를 엘ute하려면 모든 물을 제거하고 건조할 수 있습니다.
그런 다음 100%의 이소프로판올 1밀리리터를 넣고 실온에서 부드럽게 흔들리며 10분 동안 배양합니다. 에례 오일 레드 O 염료가 여러 번 이소프로파놀을 피펫하여 모든 오일 레드 O가 용액에 있는지 확인합니다. 솔루션을 큐벳으로 전송합니다.
분광측약에 의해 500 나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 100%이소프로판올을 빈값으로 사용합니다. 1X PBS로 한 번 씻어내다. 그런 다음, 보디피의 100 나노 몰러와 함께 1X PBS에서 37섭씨에서 40분 동안 희석합니다.
유동 세포측정측정에 스테인드 컨트롤이 포함되어야 합니다. 염색 용액을 제거하고 1X PBS로 한 번 셀을 세척합니다. 그런 다음 세포를 다시 씻고 PBS를 완전히 제거하십시오.
4%의 파라포름알데히드를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 제거하고 PBS에서 5분 동안 샘플을 세 번 세척합니다. 셀은 섭씨 4도에서 1X PBS로 보관하거나 즉시 이미지화할 수 있습니다.
보관을 위해 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮어 세포가 건조되는 것을 방지합니다. 스테토시스의 효율적인 유도를 확인하기 위해, oleate 처리 및 제어 HepaRG 세포는 오일 레드 O 염료로 염색하였다. 염색 후, 지질 방울은 쉽게 붉은 방울로 볼 수 있습니다.
염색은 이소프로판올로 용출된 오일 R O 염료의 분광측정 측정에 의해 정량화될 수 있다. 세포로부터 용출된 오일 레드 O의 흡수성은 세포질 지질 액적 축적에 직접 비례한다. 나트륨 oleate 농도 및 노출 시간은 MTT 착색 세포 생존성 분석에 의해 결정되었다.
Formosan 제품은 490 나노미터의 흡광도에 의해 정량화되며 배양시 살아있는 세포의 수에 정비례합니다. 나트륨 oleate 치료는 나트륨 팔미타트 치료에 비교되었다. 아포톡톡스 약물 독소루비신은 대조군으로 사용되었다.
올레아테 나트륨 치료 후 세포 지질 함량의 증가를 정량화하기 위해, 보디피 염료로 염색하는 것은 지질 방울을 라벨에 사용되었다. 세포형경화 분석을 이용하여, 대조군 세포에 비해 올레아테 처리된 세포에서 더 높은 보디피에 의한 트리글리세라이드 함량을 정량화할 수 있다. 이것은 oleate 처리 후에 효율적인 지방 축적을 나타냅니다.
실제로 Bodipy 염색 된 세포의 이미지는 대조군 세포에서 볼 수없는 올레아테 처리 된 세포에서 밝은 녹색 형광 지질 방울을 보여줍니다. 올레아테 나트륨 치료 후 지질 방울의 축적을 더욱 특성화하기 위해, CARS 현미경검사는 라벨없이 지질 방울 정량화를 가능하게 하는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수행될 수 있다. 이 세포 기지를 둔 모형은 비 온코틱 지방 간 질병에 관련되은 분자 기계장치의 지식을 증가할 수 있고 조기 진단 및 새로운 처리 전략을 위한 새로운 마커의 발달로 이끌어 낼 수 있었습니다.
