Этот протокол описывает, как вызвать везикулярный стеатоз печени в дифференцированных клетках гепаРГ и методах обнаружения и количественной оценки накопления липидов. Эта модель клеток человека in vitro представляет собой ценную альтернативу моделям мышей in vivo и первичным гепатоцитам человека. Оттепель азота криоконсервированных низким проходом партии клеток HepaRG, погружая их в 37 градусов по Цельсию ванны до размораживания.
Быстро перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров размножающейся среды. После центрифугирования в течение пяти минут, отбросить супернатант и повторного перерасхода клеток в пять миллилитров размножающихся среды. Подсчитайте клетки и разбавьте для того, чтобы пластины 250000 клеток на квадратный сантиметр.
Плита клетки на 100-миллиметровой клеточной культуры блюда и обновить средний каждые два или три дня. Клетки размножаются с удвоением времени около 24 часов. Как только клетки HepaRG достигают 80%-ного слияния, отсоедините их через трех-пятиминутную инкубацию с 0,05%-трипсином раствором.
Соберите клетки в размножающиеся среды и центрифуги в течение пяти минут, как и раньше. Откажитесь от супернатанта и распространяйте клетки пятью миллилитров размножающихся сред. Опять же, подсчитайте клетки и разбавить для того, чтобы пластины 250000 клеток на квадратный сантиметр.
На этом этапе, усилить клетки, повторяя эти шаги, чтобы достичь соответствующего количества клеток, чтобы начать эксперименты. Чтобы криопресергить клетки HepaRG, отсоедините клетки через 24 часа после покрытия через трех-пятиминутную инкубацию с 0,05%трипсином раствором. Соберите клетки в размножающиеся среды и центрифуги в течение пяти минут, как и раньше.
Откажитесь от супернатанта, перерасходуйте клетки в один миллилитр на партию замораживания среды и криопресервуйте партии в жидком азоте. На нулевом дне семенные клетки HepaRG на уровне 250 000 клеток на квадратный сантиметр в обработанные культурой блюда с соответствующим объемом среды пролиферации. Два блюда должны быть поцарны для каждого анализа, один для контрольных клеток и один для oleate-обработанных клеток.
На второй день и четвертый день, изменить среду с соответствующим объемом распространения среды и пусть клетки растут, пока они не достигнут слияния. На седьмой день клетки должны быть на 100% стечены. Вымойте клетки один раз с 1X PBS.
Затем удалите 1X PBS и добавьте соответствующий объем дифференциации среды. В дни восемь, девять, 12, 15 и 18, мыть клетки один раз с 1X PBS, прежде чем добавить соответствующий объем дифференциации среды. На 21-й день наблюдайте за клетками HepaRG под микроскопом и убедитесь, что клетки являются стеченными дифференцированными культурами.
В качестве контроля, урожай одного контрольного блюда для выполнения анализа экспрессии генов маркера гена. В день 21, дифференцированные клетки HepaRG могут быть криоконсервированы в жидком азоте. На 21 день разбавляют олеатом натрия с соответствующим объемом полной дифференциации среды до конечной концентрации 250 микромолеров.
Добавить 99%метанол в соотношении от одного до 400 в другой aliquot дифференциации среды, чтобы сделать лечение управления транспортным средством. Вымойте клетки один раз с 1X PBS и добавить автомобиль или олеат натрия среды. На 23-й и 25-й день измените среду с соответствующим объемом свежеприготовленной среды.
На 26-й день наблюдайте за клетками с помощью оптической микроскопии. Липидные капли накапливаются в обработанных клетках олеата натрия и легко видны как полупрозрачные капли в цитоплазме. Для выполнения Масляный красный O окрашивания, сначала мыть клетки один раз с 1X PBS и удалить 1X PBS полностью.
Добавить 4%paraformaldehyde и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите параформальдегид и мыть клетки дважды с 1X PBS. После удаления PBS, инкубировать клетки с 60%изопропанол в течение пяти минут при комнатной температуре.
Удалите изопропанол и дайте клеткам полностью высохнуть при комнатной температуре. Теперь добавьте масляный красный O рабочий раствор в клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Объем рабочего раствора, необходимого для каждого образца, соответствует объему средств массовой информации, используемых для культивирования клеток.
Удалите раствор Oil Red O и немедленно добавьте двойную дистиллированную воду. После мытья клеток четыре раза с двойной дистиллированной водой, приобрести изображения под микроскопом для анализа. Чтобы украсить масло Красного O красителя, удалить всю воду и дайте высохнуть.
Затем добавьте один миллилитр 100%изопропанола и инкубировать в течение 10 минут с нежной тряской при комнатной температуре. Pipette изопропанол с элайтовым маслом Красный O красителя вверх и вниз несколько раз, гарантируя, что все масло Красный O находится в растворе. Перенесите раствор на кювет.
Измерьте оптическую плотность на 500 нанометров с помощью спектрофотометрии и используйте 100% изопропанол в качестве пустого. Вымойте клетки один раз с 1X PBS. Затем инкубировать 100 наномоляр бодипи разбавленных в 1X PBS в темноте в течение 40 минут при 37 градусах по Цельсию.
В измерения цитометрии потока должен быть включен неокрашиваемый контроль. Удалить окрашивание раствор и мыть клетки один раз с 1X PBS. Затем, мыть клетки снова и удалить PBS полностью.
Добавить 4%paraformaldehyde и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите параформальдегид и мыть образцы три раза в течение пяти минут в PBS. Клетки могут храниться в 1X PBS при четырех градусах цельсия или изображения немедленно.
Для хранения, оберните с Parafilm и накрыть алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Для проверки эффективной индукции стеатоза, олеат-обработанные и контрольные клетки HepaRG были окрашены в масляный красный O краситель. После окрашивания липидные капли легко видны как красные капли.
Окрашивание может быть количественно спектрофотометрическое измерение масла R O красителя eluted с изопропанолом. Поглощение эладутного масла Red O из клеток прямо пропорционально накоплению цитоплазмических липидных капель. Концентрация олеата натрия и время экспозиции определялись анализом жизнеспособности МТТ колоритной клетки.
Продукт Formosan количественно измеряется его абсорбаностью на 490 нанометров и прямо пропорционален количеству живых клеток в культуре. Лечение олеатом натрия сравнивали с лечением пальмитатом натрия. В качестве контроля использовался апоптотический препарат доксорубицин.
Для количественной оценки увеличения содержания липидов клеток после лечения олеатом натрия, окрашивание красителем Бодипи было использовано для обозначения липидных капель. Используя цитофторометрический анализ, можно количественно определить содержание триглицеридов по Bodipy средняя флуоресцентная интенсивность, которая выше в олеат-обработанных клеток по сравнению с контрольными клетками. Это указывает на эффективное накопление жира после лечения олеатом.
Действительно, изображения Бодипи-окрашенных клеток показывают ярко-зеленые флуоресцентные липидные капли в олеат-обработанных клетках, которые не видны в контрольных клетках. Для дальнейшей характеристики накопления липидных капель после лечения олеатом натрия, КАРС микроскопия может быть выполнена, как описано в текстовом протоколе, который позволяет липидных капель количественно без маркировки. Эта клеточная модель может повысить знания молекулярных механизмов, участвующих в не онкотических жировых заболеваний печени и может привести к разработке новых маркеров для ранней диагностики и новых стратегий лечения.
