Bu protokol, diferansiye HepaRG hücrelerinde karaciğer veziküler steatozun nasıl indüklenir ve lipid birikiminin saptanması ve ölçülmesi için yöntemler açıklanmaktadır. Bu in vitro insan hücre modeli in vivo fare modelleri ve birincil insan hepatositler için değerli bir alternatif temsil eder. Bir azot cryopreserved düşük passage toplu HepaRG hücreleri 37 derece santigrat banyo içine batırarak çözülür buzları çözülene kadar.
Hücreleri hızla 10 mililitre çoğalan ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Beş dakika santrifüj ettikten sonra, supernatant atın ve çoğalan orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri sayVe santimetre kare başına 250, 000 hücreleri plaka için seyreltin.
Hücreleri 100 milimetrelik hücre kültürü tabaklarına plakalayın ve her iki veya üç günde bir ortamı yenileyin. Hücreler yaklaşık 24 saatlik bir süre ile çoğalır. HepaRG hücreleri %80 biraraya geldiklerinde, %0,05 tripsin çözeltisi ile üç ila beş dakikalık bir kuluçka dan ayırın.
Hücreleri çoğalan orta ve santrifüjde daha önce olduğu gibi beş dakika toplayın. Supernatant atın ve çoğalan orta beş mililitre ile hücreleri yeniden askıya. Yine, hücreleri saymak ve plaka için seyreltmek 250, santimetre kare başına 000 hücreleri.
Bu aşamada, deneyleri başlatmak için uygun sayıda hücreye ulaşmak için bu adımları yineleyerek hücreleri yükseltin. HepaRG hücrelerini kriyokorunmuş olarak, hücreleri %0,05 tripsin çözeltisi ile üç ila beş dakikalık bir kuluçka dan 24 saat sonra ayırın. Hücreleri çoğalan orta ve santrifüjde daha önce olduğu gibi beş dakika toplayın.
Supernatant atın, dondurucu ortam toplu başına bir mililitre hücreleri resuspend, ve sıvı azot toplu dondurucu. Gün sıfır, tohum HepaRG hücreleri 250, 000 hücre kare santimetre başına kültür tedavi yemekleri içine proliferasyon ortamı uygun bir hacim ile. Her bir teşp için iki tabak, kontrol hücreleri için bir ve oleate ile tedavi edilen hücreler için bir tabak gerekir.
İkinci gün ve dördüncü günde, ortamı uygun bir çoğalma hacmiyle değiştirin ve hücrelerin birleştiği zamana kadar büyümesine izin verin. Yedinci günde, hücreler %100 konfluent olmalıdır. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın.
Ardından, 1X PBS'yi çıkarın ve uygun bir farklılaştırma ortamı hacmi ekleyin. Sekiz, dokuz, 12, 15 ve 18 günlerinde, uygun bir farklılaşma ortamı hacmi eklemeden önce hücreleri bir kez 1X PBS ile yıkayın. 21. günde HepaRG hücrelerini mikroskop altında gözlemleyin ve hücrelerin eşzamanlı farklıkültürler olduğundan emin olun.
Bir kontrol olarak, farklılaşma belirteç genlerinin gen ekspresyonu analizi gerçekleştirmek için bir kontrol çanak hasat. 21. günde, diferansiye HepaRG hücreleri sıvı nitrojende kriyoopreserved olabilir. 21. günde seyreltik sodyum, 250 mikromos'luk son konsantrasyona kadar uygun bir tam farklılaşma hacmi ile oleate.
Araç kontrol tedavisi yapmak için farklılaşma ortamının başka bir aliquot içine bir ila 400 oranında% 99 metanol ekleyin. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın ve araç veya sodyum oleat ortamı ekleyin. 23. gün ve 25.
26. günde, optik mikroskopi ile hücreleri gözlemleyin. Lipid damlacıkları sodyum oleat tedavi hücrelerinde birikir ve kolayca sitoplazmada yarı saydam damlacıklar olarak görülebilir. Yağ Kırmızı O boyama gerçekleştirmek için, ilk 1X PBS ile hücreleri bir kez yıkayın ve tamamen 1X PBS kaldırın.
Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve kuluçka ya ekleyin. Paraformaldehit çıkarın ve 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. PBS çıkardıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 60 izopropanol ile hücreleri kuluçka.
Isopropanol çıkarın ve hücrelerin oda sıcaklığında tamamen kurumasına izin. Şimdi hücrelere Yağ Kırmızı O çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Her örnek için gerekli çalışma çözümünün hacmi, hücreleri birliş için kullanılan ortam hacmine karşılık gelir.
Yağ Kırmızı O çözeltisini çıkarın ve hemen çift distile su ekleyin. Hücreleri çift distile su ile dört kez yıkadıktan sonra, analiz için mikroskop altında görüntüleri elde. Yağ Kırmızı O boya yıkar, tüm su çıkarın ve kurumasını bekleyin.
Sonra, oda sıcaklığında hafif sallayarak 10 dakika boyunca% 100 isopropanol ve kuluçka bir mililitre ekleyin. Pipet eluted Oil Red O boya ile isopropanol birkaç kez yukarı ve aşağı, tüm Petrol Red O çözüm olmasını sağlamak. Çözümü bir cuvette aktarın.
Optik yoğunluğu 500 nanometre de spektrofotometri ile ölçün ve boş olarak%100 isopropanol kullanın. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın. Sonra, 100 nanomolar Bodipy ile inkübül 37 santigrat derece 40 dakika karanlıkta 1X PBS seyreltilmiş.
Akış sitometri ölçümlerine lekesiz bir kontrol eklenmelidir. Boyama çözeltisini çıkarın ve hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra hücreleri tekrar yıkayın ve PBS'yi tamamen çıkarın.
Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve kuluçka ya ekleyin. Paraformaldehit çıkarın ve PBS beş dakika boyunca üç kez örnekleri yıkayın. Hücreler 1X PBS'de dört santigrat derecede tutulabilir veya hemen görüntülenebilir.
Depolama için Parafilm ile sarın ve hücrelerin kurumasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplayın. Steatozun etkin indüksiyonuna doğru lazim, oleate ile tedavi edilir ve HepaRG hücrelerini kontrol etmek Için Oil Red O boyası ile boyandı. Boyama sonra, lipid damlacıkları kolayca kırmızı damlacıklar olarak görülebilir.
Boyama izopropanol ile eluted Oil R O boya spektrofotometrik ölçüm ile ölçülebilir. Hücrelerden eluted Oil Red O absorbeance doğrudan sitoplazmik lipid damlacık birikimi ile orantılıdır. Sodyum oleat konsantrasyonu ve maruz kalma süresi MTT kolorimetrik hücre canlılığı tayini ile belirlendi.
Formosan ürün 490 nanometre de emiciliği ile ölçülür ve kültürde yaşayan hücrelerin sayısı ile doğru orantılıdır. Sodyum oleat tedavisi sodyum palmitat tedavisi ile karşılaştırıldı. Apoptotik ilaç doksorubisin bir kontrol olarak kullanılmıştır.
Sodyum oleat tedavisi sonrası hücresel lipid içeriğinin artmasını ölçmek için, Bodipy boya ile boyama lipid damlacıkları etiketlemek için kullanılmıştır. Sitoflorometrik analiz kullanılarak, trigliserid içeriğinin kontrol hücrelerine göre oleatla tedavi edilen hücrelerde daha yüksek olan Bodipy ortalama floresan yoğunluğu ile ölçülmesi mümkündür. Bu oleate tedavi den sonra verimli yağ birikimi gösterir.
Gerçekten de, Bodipy-lekeli hücrelerin görüntüleri kontrol hücrelerinde görünmez oleat tedavi hücrelerde parlak yeşil floresan lipid damlacıkları göstermektedir. Sodyum oleat tedavisi sonrası lipid damlacıklarının birikimini daha da karakterize etmek için, CARS mikroskopisi etiketleme den olmadan lipid damlacıklarının sayısallaştırılmasını sağlayan metin protokolünde açıklandığı şekilde yapılabilir. Bu hücre tabanlı model, onkotik olmayan yağlı karaciğer hastalığında rol oynayan moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgileri artırabilir ve erken tanı ve yeni tedavi stratejileri için yeni belirteçlerin geliştirilmesine yol açabilir.
