このプロトコルは、脂質蓄積の検出と定量のための方法と分化 HepaRG 細胞で肝臓の小胞性脂肪症を誘導する方法を記述します。.このインビトロヒト細胞モデルは、生体内マウスモデルおよび原発性ヒト肝細胞に代わる貴重な代替手段となる。脱霜するまで37度摂氏バスに浸漬することにより、HepaRG細胞の窒素凍結保存低通過バッチを解凍する。
増殖培地の10ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに急速に細胞を移す。5分間遠心した後、上清を捨て、増殖培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を数え、1平方センチメートルあたり250,000個の細胞をプレートするために希釈する。
100ミリメートルの細胞培養皿に細胞をプレートし、2〜3日ごとに培地を更新します。細胞は約24時間の倍加時間で増殖する。HepaRG細胞が80%の合流度に達したら、0.05%トリプシン溶液で3〜5分間のインキュベーションを経て取り外します。
増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間収集します。上清を捨て、増殖培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。繰り返しますが、細胞を数え、1平方センチメートルあたり250,000個の細胞をプレートするために希釈する。
この段階では、これらのステップを繰り返して細胞を増幅し、実験を開始する適切な数の細胞に到達する。HepaRG細胞を凍結保存するには、0.05%トリプシン溶液で3〜5分間のインキュベーションを通してめっきした24時間後に細胞を取り外します。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間収集します。
上清を捨て、凍結培地の1バッチあたり1ミリリットルで細胞を再懸濁し、液体窒素中のバッチを凍結保存する。ゼロ日目に、HepaRG細胞を250,000平方センチメートルで播種し、適切な量の増殖培地を有する培養処理された料理に入る。2つの皿は、各アッセイのために、コントロール細胞用とオレエード処理細胞用に1つ、メッキする必要があります。
2日目と4日目に、適切な量の増殖培地で培地を交換し、合流するまで細胞を増殖させます。7日目には、細胞は100%コンフルエントでなければなりません。1X PBSで細胞を1回洗います。
その後、1X PBSを取り出し、適切な分化媒体のボリュームを追加します。8日目、9日目、12日目、15日目、18日目に、細胞を1X PBSで1回洗浄してから、適切な分化培地を添加します。21日目に、HepaRG細胞を顕微鏡で観察し、細胞がコンフルエント分化培養であることを確認する。
コントロールとして、1つの対照皿を収穫し、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析を行う。21日目において、分化したHepaRG細胞は液体窒素中で凍結保存することができる。21日目に、オレイン酸ナトリウムを、完全な分化培地の適切な量で希釈し、最終濃度の250マイクロモルにする。
99%メタノールを1~400の割合で分化媒体の別のアリコートに加え、車両制御処理を行います。1X PBSで細胞を1回洗浄し、車両またはオレイン酸ナトリウム培地を添加します。23日目および25日目に、調製した培地の適切な量で培地を交換する。
26日目に、光学顕微鏡で細胞を観察する。脂質滴は、オレイン酸ナトリウム処理細胞に蓄積し、細胞質中の半透明の液滴として容易に見える。オイルレッドO染色を行うために、まず1X PBSで細胞を1回洗浄し、1X PBSを完全に除去します。
4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを取り出し、1X PBSで細胞を2回洗浄します。PBSを取り除いた後、室温で5分間60%イソプロパノールで細胞をインキュベートする。
イソプロパノールを取り出し、細胞を室温で完全に乾燥させます。オイルレッドOの働き溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。各サンプルに必要な作業溶液の量は、細胞の培養に使用されるメディアの量に対応します。
オイルレッドO溶液を取り外し、すぐに二重蒸留水を加えます。二重蒸留水で細胞を4回洗浄した後、顕微鏡下で画像を取得して分析します。オイルレッドO染料を溶かすために、すべての水を取り除き、乾燥させます。
その後、100%イソプロパノールの1ミリリットルを加え、室温で穏やかな揺れをして10分間インキュベートします。イソプロパノールを溶出したオイルレッドO染料を数回上下にピペットし、すべてのオイルレッドOが溶液中であることを保証します。溶液をキュヴェットに移します。
分光光度計で500ナノメートルの光学濃度を測定し、ブランクとして100%イソプロパノールを使用します。1X PBSで細胞を1回洗います。その後、100ナノモルのボディーを暗闇の中で1X PBSで37°Cで40分間希釈してインキュベートする。
未染色のコントロールは、フローサイトメトリー測定に含まれるべきです。染色液を取り出し、1X PBSで細胞を1回洗います。その後、再度細胞を洗浄し、PBSを完全に除去します。
4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを取り出し、PBSでサンプルを5分間3回洗浄します。細胞は摂氏4度で1X PBSに保つか、すぐに画像化することができる。
保管の場合は、パラフィルムで包み、アルミニウム箔で覆い、細胞が乾燥するのを防ぎます。ステアトーシスの効率的な誘導を検証するために、油性処理およびコントロールHepaRG細胞をオイルレッドO色素で染色した。染色後、脂質滴は赤い液滴として容易に見える。
染色は、イソプロパノールで溶出した油性RO色素の分光光度測定により定量することができる。細胞から溶出したオイルレッドOの吸光度は、細胞質脂質滴集積に直接比例する。オレイン酸ナトリウム濃度および曝露時間は、MTTの着色細胞生存率測定法によって決定した。
Formosan製品は、490ナノメートルの吸光度によって定量化され、培養中の生細胞の数に直接比例します。オレイン酸ナトリウム処理をパルミテナトリウム処理と比較した。アポトーシス薬ドキソルビシンをコントロールとして使用した。
オレイン酸ナトリウム処理後の細胞脂質含有量の増加を定量化するために、ボディー色素による染色を使用して脂質滴を標識した。細胞フルオロメトリック分析を用いて、コントロール細胞と比較してオレイン酸処理細胞において高い蛍光強度を意味するBodipy平均によるトリグリセリド含有量を定量化することができる。これは、オレエード処理後の効率的な脂肪蓄積を示す。
実際、Bodipy染色された細胞の画像は、コントロール細胞に見えないオレア酸処理細胞の明るい緑色の蛍光脂質液滴を示す。オレイン酸ナトリウム処理後の脂質滴の蓄積をさらに特徴付けるために、CARS顕微鏡法は、標識を行わずに脂質滴定量を可能にするテキストプロトコルに記載されているように行うことができる。この細胞ベースのモデルは、非発性脂肪性肝疾患に関与する分子メカニズムに関する知識を高め、早期診断と新しい治療戦略のための新しいマーカーの開発につながる可能性があります。
