奇托桑膜上人类牙周韧带细胞球体的形成

这是一个详细的协议，通过切托桑薄膜培养周周韧带细胞球体。与传统培养系统相比，球状培养系统产生具有增强自我更新和骨源分化能力的周周韧带细胞。首先，按照手稿中指示，准备 1% 的重量到体积的气当液溶液。

将 0.5 毫升甲氨基齐桑溶液加入 24 孔组织培养聚苯乙烯板的每个孔中。在60摄氏度的烤箱中干燥盘子24小时，形成气膜。要中和甲酸山薄膜，在24井板的每个井中加入0.5毫升0.5普通氢氧化钠，并在室温下孵育两小时。

然后，用双蒸馏水洗三次气精膜。在室温下，在70%酒精中对齐藤桑涂层的24孔板进行消毒。用 PBS 冲洗盘子三次，然后在紫外线下过夜。

在细胞播种之前，预热增殖介质、PBS溶液和尝试性EDTA溶液达到37摄氏度。从细胞培养瓶中丢弃上流液，用10毫升PBS洗涤汇合期周韧带或PDL细胞。丢弃 PBS，在烧瓶中加入一毫升的尝试素 EDTA 溶液。

在37摄氏度下孵育烧瓶3分钟，然后加入三毫升增殖介质，以终止三辛消化。将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中，然后在300倍g下将其离心5分钟。丢弃上一级，在增殖介质的500微升中重新悬浮细胞。

用血细胞计计算细胞数，并在每平方厘米5、10、30和6万个细胞的盘上播种。在5%的二氧化碳和加湿空气中培养孵化器中的PDL细胞，每周两次改变培养基。通过逆相对比显微镜每天观察细胞形态五天。

使用该协议成功形成可行的PDL细胞球体。在1天和3天，很少观察到种子密度较低的球体。但在两个更高的密度，各种大小的球体存在从第一天。

最佳播种密度为每厘米平方3万个细胞，因为它产生均匀的球状体。经过五天的培养，观察到所有播种密度的球体更大。可行性测定表明，大多数PDL细胞在1天、第3天和6天存活，但死亡细胞的数量在6天增加。

该协议的一个限制是球体形成后细胞的增殖减少。因此，需要进一步研究，以促进球状形成后细胞的增殖。