使用共同分泌的Luciferase代理物测量相对胰岛素分泌

该协议描述了从β细胞系检测胰岛素分泌的替代快速方法，以加快药物发现和表征。这种方法很有用，因为可以同时测试多种治疗方法，结果在实验后立即提供，而且这种检测方法比其他方法更实惠。该方法用于胰岛素分泌新小分子调节剂的筛选，可以识别未来糖尿病治疗的铅化合物。

增加对β细胞功能的了解有助于对蛋白质或神经递质分泌的一般知识的加深。此胰岛素分泌处理程序已建立，以在其他β细胞线和人类胰岛中使用扁病毒系统。对于熟悉细胞培养和操作多通道移液器的个人来说，这种检测应该非常简单。

在计划任何实验之前，验证您的父母或稳定的β细胞系是否使用胰岛素ELISA对葡萄糖有适当的反应。首先根据手稿说明制备克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液或KRBH和高西亚荧光素工作溶液。使用标准细胞培养技术在T75烧瓶中培养MIN6细胞。

准备InsGLuc MIN6细胞电镀，用PBS两次清洗细胞的汇合瓶，并加入两毫升的三辛。在37摄氏度下孵育细胞约5分钟，或直到细胞与烧瓶分离。确定细胞浓度，并在完整介质中稀释细胞至每毫升100万个细胞，相当于96井板每100微升的10万个细胞。

细胞应在三到四天后充分汇合以进行测定。在测定当天，为实验准备足够的无葡萄糖KRBH，并设置一个储液罐。将介质从 96 井板中清除，快速将其倒置到实验室水槽上，然后牢固地印在一叠纸巾上，以去除多余的介质。

每井用100微升无葡萄糖KRBH清洗盘子两次，如果进行药物治疗，请根据手稿说明将药物添加到KRBH中。然后，在每井中加入100微升无葡萄糖KRBH，并在37摄氏度下孵育一小时。孵育后，将缓冲液去掉，并在纸巾上印上盘子。

每井添加 100 微升无葡萄糖 KRBH，洗去任何累积的背景，然后将板冲走。添加控制和刺激条件，或不进行药物治疗，每孔100微升，并在37摄氏度下孵育板一小时。在每个板块上包括基底和刺激控制很重要，以确定给定实验中细胞的响应能力。

如果细胞随着时间的推移而失去反应，从新鲜的液氮中重新培养它们。使用多通道移液器仔细收集 50 微升的上清液，将其转移到不透明的白色 96 和测定板中，并在长椅上保持样品室温，直到准备好进行荧光素测定。通过将所需数量的CTZ溶液移液到GLuc测定缓冲液中，准备高西亚荧光素酶测定工作溶液，注意防止CTZ变暖。

使用多通道移液器，使用 KRBH 超级纳特器快速将 GLuc 检测工作溶液添加到板上。如果井两侧有任何水滴，请将板在桌面中短暂旋转，摆动铲斗离心机。然后将板放入板读卡器中，用 0.1 秒的集成时间读取发光。

通过测量胰岛素分泌，作为对葡萄糖浓度增加的反应，该检测在控制条件下进行了测试。在五毫摩尔葡萄糖以下观察到很少的分泌活性，在八毫摩尔以上观察到的分泌增加。当受到二氧化氮范式的挑战时，细胞表现出预期的分泌反应。

如果没有细胞外氯化钾，Diazoxide 治疗会阻断胰岛素分泌。当氯化钾存在时，分泌物可以通过进一步添加葡萄糖来放大。还证明，InsGLuc MIN6细胞对氯化钾、二氧化二氮、PMA和肾上腺素等分泌调节化合物的反应如预期。

按照这个程序，关键的结果应该通过分析KRBH超级纳在抗体为基础的ELISA或HTRF测定，允许确定胰岛素浓度确认。Broad 研究所的一个小组做了许多开创性的工作，为我在研究中越来越多地使用这种分析方法铺平了道路。多个研究小组，包括我们和布罗德小组，正在糖尿病领域的药物发现工作中采用这种方法。