Este protocolo describe un enfoque rápido alternativo para el ensayo de la secreción de insulina a partir de líneas celulares beta para acelerar el descubrimiento y caracterización de fármacos. Este enfoque es útil porque se pueden probar varios tratamientos simultáneamente, los resultados están disponibles inmediatamente después del experimento y este ensayo es más asequible que otros. La aplicación de este método hacia la detección de nuevos moduladores de moléculas pequeñas de secreción de insulina puede identificar compuestos principales para futuras terapias de diabetes.
Mayor conocimiento de la función de la célula beta puede contribuir a una mayor comprensión de la secreción de proteínas o neurotransmisores en general. Este reportero de secreción de insulina se ha establecido para trabajar en un sistema lentiviral en otras líneas de células beta y en islotes humanos. Este ensayo debe ser muy sencillo para las personas familiarizadas con el cultivo celular y el funcionamiento de pipetas multicanal.
Antes de planificar cualquier experimento, verifique que sus líneas celulares beta parentales o estables estén respondiendo correctamente a la glucosa utilizando una insulina ELISA. Comience preparando Krebs-Ringer Bicarbonato Buffer o KRBH y gaussia luciferase solución de trabajo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cultivar células MIN6 en matraces T75 utilizando técnicas estándar de cultivo celular.
Prepare las células InsGLuc MIN6 para el enchapado lavando un matraz de células confluentes dos veces con PBS y añadiendo dos mililitros de trippsina. Incubar las células a 37 grados centígrados durante unos cinco minutos, o hasta que las células se disocúquen del matraz. Determinar la concentración celular y diluir las células en medios completos a un millón de células por mililitro, lo que equivale a 100.000 células por cada 100 microlitros en cada pozo de una placa de 96 pozos.
Las células deben ser suficientemente confluentes para el ensayo después de tres a cuatro días. El día del ensayo, prepare suficiente KRBH libre de glucosa para el experimento y prepare un depósito. Decantar el medio de la placa de 96 pozos invirlizándolo rápidamente sobre un fregadero de laboratorio y luego hinchando firmemente en una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de medio.
Lave la placa dos veces con 100 microlitros de KRBH sin glucosa por pozo, y si realiza tratamientos farmacológicos, agregue medicamentos al KRBH de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, agregue 100 microlitros de KRBH libre de glucosa a cada pozo e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, decantar el tampón y manchar la placa sobre una toalla de papel.
Añadir 100 microlitros de KRBH libre de glucosa por pozo para lavar cualquier fondo acumulado y luego decantar la placa. Añadir condiciones de control y estimulación con o sin tratamientos farmacológicos a 100 microlitros por pozo e incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Es importante incluir controles basales y estimulados en cada placa para determinar la capacidad de respuesta de las células en un experimento dado.
Si las células han perdido su respuesta con el tiempo, reculquelándolas de un stock de nitrógeno líquido fresco. Recoja cuidadosamente 50 microlitros de sobrenadante usando una pipeta multicanal, transfiéralo a una placa de ensayo blanca opaca de 96 bien, y mantenga la muestra a temperatura ambiente en el banco hasta que esté lista para el ensayo de luciferasa. Preparar la solución de trabajo del ensayo de gaussia luciferasa pipeteando la cantidad necesaria de solución de CTZ en el tampón de ensayo GLuc, teniendo cuidado de evitar que el CTZ se caliente.
Utilice una pipeta multicanal para añadir rápidamente la solución de trabajo del ensayo GLuc a la placa con los sobrenadantes KRBH. Si hay gotas en los lados de los pozos, gire brevemente la placa en una mesa, centrifugar cubo oscilante. A continuación, coloque la placa en el lector de placas y lea la luminiscencia con un tiempo de integración de 0,1 segundos.
Este ensayo se ha probado en condiciones de control midiendo la secreción de insulina como respuesta al aumento de las concentraciones de glucosa. Se observa muy poca actividad secretora por debajo de cinco mililitroras, y se observa un aumento de la secreción por encima de ocho mililitros. Las células exhiben la respuesta secretora esperada cuando se enfrentan al paradigma del diazoxida.
El tratamiento con diazoxida bloquea la secreción de insulina si no hay cloruro de potasio extracelular. Cuando el cloruro de potasio está presente, la secreción se puede amplificar con una adición adicional de glucosa. También se ha demostrado que las células InsGLuc MIN6 responden según lo esperado a la secreción modulando compuestos como cloruro de potasio, diazoxide, PMA, y epinefrina.
Después de este procedimiento, los resultados críticos deben confirmarse mediante el análisis de los sobrenadantes KRBH en ensayos ELISA o HTRF basados en anticuerpos que permitan la determinación de las concentraciones de insulina. Un grupo del Broad Institute, que me allanó el camino para utilizar cada vez más este ensayo en mi investigación, ha realizado mucho trabajo pionero. Múltiples grupos de investigación, incluyendo nosotros y el grupo en el Broad, están utilizando este enfoque en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos en el campo de la diabetes.
