Este protocolo descreve uma abordagem rápida alternativa para avaliar a secreção de insulina a partir de linhas celulares beta para acelerar a descoberta e caracterização de drogas. Essa abordagem é útil porque vários tratamentos podem ser testados simultaneamente, os resultados estão disponíveis imediatamente após o experimento, e este ensaio é mais acessível do que outros. A aplicação deste método para triagem de novos moduladores de moléculas pequenas da secreção de insulina pode identificar compostos de chumbo para futuras terapias de diabetes.
O aumento do conhecimento da função celular beta pode contribuir para uma maior compreensão da secreção de proteínas ou neurotransmissores em geral. Este repórter de secreção de insulina foi estabelecido para trabalhar em um sistema lentiviral em outras linhas de células beta e em ilhotas humanas. Este ensaio deve ser muito simples para indivíduos familiarizados com a cultura celular e operando pipetas multicanais.
Antes de planejar qualquer experimento, verifique se suas linhas celulares beta parentais ou estáveis estão respondendo adequadamente à glicose usando uma insulina ELISA. Comece preparando Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer ou KRBH e gaussia luciferase solução de trabalho de acordo com as instruções do manuscrito. Cultivar células MIN6 em frascos T75 usando técnicas padrão de cultura celular.
Prepare as células INSGLuc MIN6 para chapeamento lavando um frasco confluente de células duas vezes com PBS e adicionando dois mililitros de trippsina. Incubar as células a 37 graus celsius por cerca de cinco minutos, ou até que as células se dissociem do frasco. Determine a concentração celular e dilua as células em mídia completa para um milhão de células por mililitro, o que equivale a 100.000 células por 100 microliters em cada poço de uma placa de 96 poços.
As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após três a quatro dias. No dia do ensaio, prepare krbh livre de glicose suficiente para o experimento e configure um reservatório. Decante o meio da placa do poço 96 invertendo-o rapidamente sobre uma pia de laboratório e, em seguida, manchando firmemente sobre uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso médio.
Lave a placa duas vezes com 100 microliters de KRBH livre de glicose por poço, e se realizar tratamentos medicamentosos, adicione drogas ao KRBH de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, adicione 100 microliters de KRBH livre de glicose a cada poço e incubar a 37 graus celsius por uma hora. Após a incubação, decante o tampão e borre a placa em uma toalha de papel.
Adicione 100 microliters de KRBH livre de glicose por poço para lavar qualquer fundo acumulado e, em seguida, decantar a placa. Adicione o controle e as condições estimuladoras com ou sem tratamentos medicamentosos a 100 microliters por poço e incubar a placa a 37 graus celsius por uma hora. É importante incluir controles basais e estimulados em cada placa, a fim de determinar a capacidade de resposta das células em um determinado experimento.
Se as células perderam sua resposta ao longo do tempo, recultura-las a partir de um estoque de nitrogênio líquido fresco. Colete cuidadosamente 50 microlitadores de supernacidos usando uma pipeta multicanal, transfira-a para uma placa de ensaio branca opaca 96 e mantenha a amostra em temperatura ambiente no banco até estar pronta para o ensaio da luciferase. Prepare a solução de trabalho de ensaio gaussia luciferase, canalizando a quantidade necessária de solução CTZ no tampão de ensaio GLuc, tomando cuidado para evitar que o CTZ aqueça.
Use uma pipeta multicanal para adicionar rapidamente a solução de trabalho de ensaio GLuc à placa com os supernantes KRBH. Se houver alguma gotícula nas laterais dos poços, gire brevemente a placa em uma mesa, balance a centrífuga do balde. Em seguida, coloque a placa no leitor de placas e leia a luminescência com um tempo de integração de 0,1 segundo.
Este ensaio foi testado sob condições de controle medindo a secreção de insulina como resposta ao aumento das concentrações de glicose. Muito pouca atividade secreta é observada abaixo de cinco milimólares de glicose, e o aumento da secreção é observado acima de oito milimallares. As células exibem a resposta secreta esperada quando desafiadas com o paradigma diazoxide.
O tratamento com diazoxida bloqueia a secreção de insulina se não houver cloreto de potássio extracelular. Quando o cloreto de potássio estiver presente, a secreção pode ser amplificada com mais adição de glicose. Também foi demonstrado que as células InsGLuc MIN6 respondem como esperado para a secreção de compostos moduladores como cloreto de potássio, diazóxido, PMA e epinefrino.
Após este procedimento, os resultados críticos devem ser confirmados analisando os supernaentes KRBH em ensaios ELISA ou HTRF baseados em anticorpos que permitem a determinação das concentrações de insulina. Muito trabalho pioneiro tem sido feito por um grupo do Broad Institute, que abriu o caminho para que eu usasse cada vez mais este ensaio na minha pesquisa. Vários grupos de pesquisa, incluindo nós e o grupo no Broad, estão usando essa abordagem em esforços de descoberta de drogas no campo da diabetes.
