פרוטוקול זה מתאר גישה מהירה חלופית לגילוי הפרשת אינסולין מקווי תאי בטא כדי לזרז גילוי ואפיון של תרופות. גישה זו שימושית מכיוון שניתן לבדוק טיפולים מרובים בו זמנית, התוצאות זמינות מיד לאחר הניסוי, ובדיקה זו זולה יותר מאחרים. היישום של שיטה זו לקראת הקרנה עבור אפנונים מולקולה קטנה חדשה של הפרשת אינסולין עשוי לזהות תרכובות עופרת לטיפולים עתידיים בסוכרת.
ידע מוגבר בתפקוד תאי בטא יכול לתרום להבנה טובה יותר של הפרשת חלבון או נוירוטרנסמיטר באופן כללי. כתב הפרשת אינסולין זה הוקם לעבוד במערכת lentiviral בקווי תאי בטא אחרים ובאיים אנושיים. היכרות זו צריכה להיות פשוטה מאוד לאנשים המכירים את תרבות התאים ומפעילים פיפטים רב-ערוציים.
לפני תכנון ניסויים כלשהם, ודאו שקווי תאי הבטא ההוריים או היציבים שלכם מגיבים כראוי לגלוקוז באמצעות ELISA של אינסולין. התחל על ידי הכנת קרבס-רינגר ביקרבונט Buffer או KRBH ו גאוסיה לוציפראז פתרון עבודה על פי הוראות כתב היד. לגדל תאי MIN6 בבקבוקי T75 באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות תאים.
הכן את תאי Min6 InsGLuc עבור ציפוי על ידי שטיפת בקבוקון confluent של תאים פעמיים עם PBS והוספת שני מיליליטר של טריפסין. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות, או עד התאים להתנתק מן הבקבוק. לקבוע את ריכוז התאים ולדלל את התאים במדיה מלאה למיליון תאים למיליליטר, אשר משווה ל 100, 000 תאים לכל 100 microliters בכל באר של צלחת 96 באר.
התאים צריכים להיות מספיק נוחים להתרגם לאחר שלושה עד ארבעה ימים. ביום ההתרכך, הכינו מספיק KRBH ללא גלוקוז לניסוי וקנו מאגר מים. Decant המדיום מן צלחת 96 גם על ידי היפוך מהיר אותו מעל כיור מעבדה ולאחר מכן סופג בחוזקה על ערימה של מגבות נייר כדי להסיר מדיום עודף.
לשטוף את הצלחת פעמיים עם 100 microliters של KRBH חינם גלוקוז לגם, ואם ביצוע טיפולים תרופתיים, להוסיף תרופות KRBH על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של KRBH ללא גלוקוז לכל באר ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, decant החיץ כתם את הצלחת על מגבת נייר.
הוסף 100 microliters של גלוקוז חינם KRBH לבא לשטוף את כל הרקע שנצבר ולאחר מכן decant את הצלחת. מוסיפים שליטה וגירויים עם או בלי טיפולים תרופתיים ב 100 microliters לגם דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. חשוב לכלול פקדים בזליים ומעוררים על כל צלחת על מנת לקבוע את ההיענות של התאים בניסוי נתון.
אם התאים איבדו את תגובתם לאורך זמן, לתרבות אותם מחדש ממלאי חנקן נוזלי טרי. בזהירות לאסוף 50 microliters של על טבעי באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר אותו לבן אטום 96 צלחת גם, ולשמור את המדגם בטמפרטורת החדר על הספסל עד מוכן לתדהמת luciferase. הכן את פתרון הבדיקה של גאוסיה לוציפראז על ידי צינור הכמות הנדרשת של פתרון CTZ למאגר הבדיקה של GLuc, תוך טיפול במניעת התחממות CTZ.
השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף במהירות את הפתרון GLuc לתעתעת עבודה לצלחת עם על טבעי KRBH. אם יש טיפות בצדי הבאר, לזמן קצר לסובב את הצלחת בשולחן, נדנדה דלי צנטריפוגה. לאחר מכן לשים את הצלחת הקורא צלחת ולקרוא את luminescence עם זמן אינטגרציה 0.1 השני.
בדיקה זו נבדקה בתנאי בקרה על ידי מדידת הפרשת אינסולין כתגובה להגברת ריכוזי הגלוקוז. מעט מאוד פעילות הפרשה נצפתה מתחת חמישה גלוקוז מילימולר, הפרשה מוגברת נצפתה מעל שמונה מילימולר. התאים מפגינים את תגובת הפרשה הצפויה כאשר הם מאותגרים בפרדיגמה של דיאזוקסיד.
טיפול דיאזוקסיד חוסם הפרשת אינסולין אם אין אשלגן כלורי חוץ תאי. כאשר אשלגן כלורי קיים, הפרשה יכולה להיות מוגברת עם תוספת נוספת של גלוקוז. הוכח גם כי תאי Min6 InsGLuc מגיבים כצפוי הפרשת תרכובות אפנון כגון אשלגן כלורי, דיאזוקסיד, PMA, ואפינפרין.
בעקבות הליך זה, יש לאשר תוצאות קריטיות על ידי ניתוח על טבעי KRBH בבדיקות ELISA או HTRF מבוססות נוגדנים המאפשרות קביעת ריכוזי אינסולין. הרבה עבודה חלוצית נעשתה על ידי קבוצה במכון ברוד, שסללה לי את הדרך להשתמש יותר ויותר בהסתעפות הזו במחקר שלי. קבוצות מחקר רבות, כולל אנחנו והקבוצה בברוד, משתמשות בגישה זו במאמצי גילוי תרופות בתחום הסוכרת.
