Ce protocole décrit une approche rapide alternative pour l’analyse de la sécrétion d’insuline à partir des lignées de cellules bêta pour accélérer la découverte et la caractérisation des médicaments. Cette approche est utile parce que plusieurs traitements peuvent être testés simultanément, les résultats sont disponibles immédiatement après l’expérience, et cet essai est plus abordable que d’autres. L’application de cette méthode vers le dépistage de nouveaux modulateurs de petites molécules de sécrétion d’insuline peut identifier les composés de plomb pour les futures thérapies contre le diabète.
Une meilleure connaissance de la fonction des cellules bêta peut contribuer à une meilleure compréhension de la sécrétion de protéines ou de neurotransmetteurs en général. Ce journaliste de sécrétion d’insuline a été établi pour travailler dans un système lentiviral dans d’autres lignes de cellules bêta et dans les îlots humains. Cet essai devrait être très simple pour les personnes familières avec la culture cellulaire et l’exploitation de pipettes multicanaux.
Avant de planifier des expériences, vérifiez que vos lignées de cellules bêta parentales ou stables réagissent correctement au glucose à l’aide d’une insuline ELISA. Commencez par préparer Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer ou KRBH et gaussia luciferase solution de travail selon les instructions manuscrites. Cultiver des cellules MIN6 dans des flacons T75 en utilisant des techniques standard de culture cellulaire.
Préparer les cellules InsGLuc MIN6 pour le placage en lavant deux fois un flacon confluent de cellules avec PBS et en ajoutant deux millilitres de trypsine. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes, ou jusqu’à ce que les cellules se dissocient de la fiole. Déterminer la concentration cellulaire et diluer les cellules dans un média complet à un million de cellules par millilitre, ce qui équivaut à 100 000 cellules par 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque de puits de 96.
Les cellules doivent être suffisamment confluentes pour le test après trois à quatre jours. Le jour de l’essai, préparez suffisamment de KRBH sans glucose pour l’expérience et installez un réservoir. Décanter le milieu de la plaque de puits 96 en l’inversant rapidement sur un évier de laboratoire, puis en buvant fermement sur une pile de serviettes en papier pour enlever l’excès de milieu.
Lavez la plaque deux fois avec 100 microlitres de KRBH sans glucose par puits, et si vous effectuez des traitements médicamenteux, ajoutez des médicaments au KRBH selon les directives manuscrites. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de KRBH sans glucose à chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, décanter le tampon et éponger la plaque sur une serviette en papier.
Ajouter 100 microlitres de KRBH sans glucose par puits pour laver tout fond accumulé, puis décanter la plaque. Ajoutez des conditions de contrôle et de stimulation avec ou sans traitements médicamenteux à 100 microlitres par puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Il est important d’inclure des contrôles basaux et stimulés sur chaque plaque afin de déterminer la réactivité des cellules dans une expérience donnée.
Si les cellules ont perdu leur réponse au fil du temps, reculturez-les à partir d’un stock d’azote liquide frais. Recueillir soigneusement 50 microlitres de supernatant à l’aide d’une pipette multicanal, le transférer dans une plaque blanche opaque 96 et conserver l’échantillon à température ambiante sur le banc jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le test de luciferase. Préparez la solution de travail gaussia luciferase en pipetant la quantité requise de solution CTZ dans le tampon d’analyse GLuc, en prenant soin d’empêcher le CTZ de se réchauffer.
Utilisez une pipette multicanal pour ajouter rapidement la solution de travail d’analyse GLuc à la plaque avec les supernatants KRBH. S’il y a des gouttelettes sur les côtés des puits, tournez brièvement la plaque dans une table, balancez la centrifugeuse de seau. Ensuite, mettez la plaque dans le lecteur de plaque et lisez la luminescence avec un temps d’intégration de 0,1 seconde.
Cet essai a été examiné dans des conditions de contrôle en mesurant la sécrétion d’insuline comme réponse à l’augmentation des concentrations de glucose. Très peu d’activité sécrétaire est observée au-dessous de cinq millimolar glucose, et la sécrétion accrue est observée au-dessus de huit millimolar. Les cellules montrent la réponse sécrétaire attendue lorsqu’elles sont contestées avec le paradigme du diazoxyde.
Le traitement au diazoxyde bloque la sécrétion d’insuline s’il n’y a pas de chlorure de potassium extracellulaire. Lorsque le chlorure de potassium est présent, la sécrétion peut être amplifiée avec un ajout supplémentaire de glucose. Il a également été démontré que les cellules InsGLuc MIN6 réagissent comme prévu à la sécrétion de composés modulants tels que le chlorure de potassium, le diazoxyde, la PMA et l’épinéphrine.
Après cette procédure, les résultats critiques devraient être confirmés en analysant les supernatants KRBH dans les tests ELISA ou HTRF à base d’anticorps qui permettent de déterminer les concentrations d’insuline. Un groupe du Broad Institute a fait beaucoup de travail de pionnier, ce qui m’a permis d’utiliser de plus en plus cet essai dans mes recherches. Plusieurs groupes de recherche, dont nous et le groupe au Broad, utilisent cette approche dans les efforts de découverte de médicaments dans le domaine du diabète.
