Questo protocollo descrive un approccio rapido alternativo per il dosaggio della secrezione di insulina dalle linee cellulari beta per accelerare la scoperta e la caratterizzazione dei farmaci. Questo approccio è utile perché più trattamenti possono essere testati contemporaneamente, i risultati sono disponibili immediatamente dopo l'esperimento e questo test è più conveniente di altri. L'applicazione di questo metodo allo screening per nuovi modulatori di piccole molecole di secrezione di insulina può identificare composti di piombo per future terapie per il diabete.
Una maggiore conoscenza della funzione delle cellule beta può contribuire a una maggiore comprensione della secrezione di proteine o neurotrasmettitori in generale. Questo reporter di secrezione di insulina è stato stabilito per lavorare in un sistema lentivirale in altre linee di cellule beta e negli isolotti umani. Questo saggio dovrebbe essere molto semplice per gli individui che hanno familiarità con la coltura cellulare e gestiscono pipette multicanale.
Prima di pianificare qualsiasi esperimento, verificare che le linee cellulari beta parentali o stabili rispondano correttamente al glucosio utilizzando un ELISA di insulina. Inizia preparando krebs-ringer bicarbonato buffer o KRBH e gaussia luciferasi soluzione di lavoro secondo le indicazioni manoscritte. Far crescere le cellule MIN6 nei contenitori T75 utilizzando tecniche standard di coltura cellulare.
Preparare le celle InsGLuc MIN6 per la placcatura lavando due volte un pallone confluente di cellule con PBS e aggiungendo due millilitri di tripina. Incubare le cellule a 37 gradi celsius per circa cinque minuti o fino a quando le cellule non si dissociano dal pallone. Determinare la concentrazione cellulare e diluire le cellule in mezzo completo a un milione di cellule per millilitro, che equivale a 100.000 cellule per 100 microlitri in ogni pozzo di una piastra di 96 pozzetti.
Le cellule devono essere sufficientemente confluenti per il saggio dopo tre o quattro giorni. Il giorno del test, preparare un KRBH abbastanza privo di glucosio per l'esperimento e impostare un serbatoio. Decantare il mezzo dalla piastra del pozzo 96 inverterlo rapidamente su un lavandino da laboratorio e quindi soffiare saldamente su una pila di tovaglioli di carta per rimuovere il mezzo in eccesso.
Lavare il piatto due volte con 100 microlitri di KRBH senza glucosio per pozzo e, se si eseguono trattamenti farmacologici, aggiungere farmaci al KRBH secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi, aggiungere 100 microlitri di KRBH privo di glucosio ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, decantare il tampone e asciugare la piastra su un tovagliolo di carta.
Aggiungere 100 microlitri di KRBH senza glucosio per pozzo per lavare via qualsiasi sfondo accumulato e quindi decantare la piastra. Aggiungere condizioni di controllo e stimolo con o senza trattamenti farmacologici a 100 microlitri per pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. È importante includere controlli basali e stimolati su ogni piastra al fine di determinare la reattività delle cellule in un dato esperimento.
Se le cellule hanno perso la loro risposta nel tempo, riculle da un nuovo stock di azoto liquido. Raccogliere con cura 50 microlitri di supernatante utilizzando una pipetta multicanale, trasferirlo su una piastra di dosaggio bianca opaca da 96 pozzi e mantenere il campione a temperatura ambiente sul banco fino a quando non è pronto per il saggio luciferasi. Preparare la soluzione di lavoro del saggio gaussia luciferasi pipettando la quantità richiesta di soluzione CTZ nel tampone di dosaggio GLuc, facendo attenzione a evitare il riscaldamento della CTZ.
Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere rapidamente la soluzione di lavoro del test GLuc alla piastra con i supernatanti KRBH. Se ci sono goccioline ai lati dei pozzi, ruotare brevemente la piastra in un piano del tavolo, centrifuga a secchiello oscillante. Quindi metti la piastra nel lettore di lastre e leggi la luminescenza con un tempo di integrazione di 0,1 secondi.
Questo saggio è stato testato in condizioni di controllo misurando la secrezione di insulina come risposta all'aumento delle concentrazioni di glucosio. Si osserva pochissima attività secretoria al di sotto di cinque millimolari di glucosio e si osserva una maggiore secrezione sopra gli otto millimolari. Le cellule mostrano la risposta secretoria attesa quando sfidate con il paradigma del diazossido.
Il trattamento con diazossido blocca la secrezione di insulina se non c'è cloruro di potassio extracellulare. Quando è presente cloruro di potassio, la secrezione può essere amplificata con un'ulteriore aggiunta di glucosio. È stato anche dimostrato che le cellule di InsGLuc MIN6 rispondono come previsto ai composti modulanti di secrezione come cloruro di potassio, diazossido, PMA ed enefrina.
A seguito di questa procedura, i risultati critici devono essere confermati analizzando i supernanti KRBH nei test ELISA o HTRF a base di anticorpi che consentono la determinazione delle concentrazioni di insulina. Un grande lavoro pionieristico è stato svolto da un gruppo del Broad Institute, che mi ha spianato la strada per utilizzare sempre più questo saggio nella mia ricerca. Diversi gruppi di ricerca, tra cui noi e il gruppo del Broad, stanno usando questo approccio negli sforzi di scoperta di farmaci nel campo del diabete.
