Bu protokol, ilaç keşfini ve karakterizasyonunu hızlandırmak için beta hücre hatlarından insülin salgısını tespit etmek için alternatif bir hızlı yaklaşım tanımlar. Birden fazla tedavi aynı anda test edilebilir, çünkü bu yaklaşım yararlıdır, sonuçlar denemehemen ardından kullanılabilir, ve bu taht diğerlerinden daha uygun fiyatlı. İnsülin salgılayıcılarının yeni küçük molekül modülatörlerinin taranmasına yönelik bu yöntemin uygulanması gelecekteki diyabet tedavileri için kurşun bileşikleri belirleyebilir.
Beta hücre fonksiyonunun artan bilgi genel olarak protein veya nörotransmitter salgısını daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir. Bu insülin salgı muhabiri diğer beta hücreleri hatları nda ve insan adacıklarında lentiviral bir sistemde çalışmak üzere kurulmuştur. Bu tsay hücre kültürü ve işletim çok kanallı pipetler aşina bireyler için çok basit olmalıdır.
Herhangi bir deney planlamadan önce, ebeveyn veya istikrarlı beta hücre hatları bir insülin ELISA kullanarak glikoz düzgün yanıt olduğunu doğrulayın. Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon veya KRBH ve gaussia luciferase çalışma çözümlerini el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın. Standart hücre kültürü tekniklerini kullanarak T75 şişelerinde MIN6 hücrelerini büyütün.
InsGLuc MIN6 hücrelerini PBS ile iki kez hücre bir confluent şişe yıkama ve trypsin iki mililitre ekleyerek kaplama için hazırlayın. Hücreleri yaklaşık beş dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, ya da hücreler şişeden ayrışana kadar. Hücre konsantrasyonu belirlemek ve mililitre başına bir milyon hücreye tam ortamda hücreleri seyreltmek, hangi eşittir 100 mikrolitre başına 100 mikrolitre bir 96 iyi plaka.
Hücreler üç ila dört gün sonra yeterli teşp için confluent olmalıdır. Deneme günü, deney için yeterli glikozsuz KRBH hazırlamak ve bir rezervuar kurmak. 96 kuyu plakasından ortayı hızlı bir şekilde bir laboratuvar lavabosu üzerinde ters çevirerek ve sonra fazla ortamı çıkarmak için kağıt havlu yığını üzerinde sıkıca lekeleyerek çıkarın.
Plakayı her kuyuda 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ile iki kez yıkayın ve ilaç tedavisi yapıyorsanız, el yazması talimatlara göre KRBH'ye ilaç ekleyin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ekleyin ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra tamponu dekant edin ve tabağı kağıt havlunun üzerine dökün.
Herhangi bir birikmiş arka plan yıkamak ve daha sonra plaka decant iyi başına glikoz ücretsiz KRBH 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 100 mikrolitre de ilaç tedavileri ile veya olmadan kontrol ve uyarıcı koşulları ekleyin ve bir saat boyunca 37 derece santigrat plaka kuluçka. Belirli bir deneydeki hücrelerin yanıt verme yeteneğini belirlemek için her plakaya bazal ve uyarılmış kontroller eklemek önemlidir.
Hücreler zaman içinde tepkilerini kaybettiyse, onları taze sıvı nitrojen stoğundan yeniden yetiştirin. Çok kanallı pipet kullanarak 50 mikrolitre süpernatant toplayın, opak beyaz 96 iyi bir test tabağına aktarın ve numuneyi luciferase tsay'ı hazır olana kadar tezgahta oda sıcaklığında tutun. Gerekli miktarda CTZ çözeltisini GLuc istif arabelleğine boru layarak, CTZ'nin ısınmasını önlemeye özen tutarak gaussia luciferase çalışma çözümünün hazırlanın.
KRBH süpernatantları ile plakaya GLuc tsay çalışma çözümlerini hızlı bir şekilde eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Kuyuların yanlarında damlacıklar varsa, kısaca bir masa, salıncak kova santrifüj plaka spin. Sonra plaka okuyucu koymak ve 0.1 saniye entegrasyon süresi ile parlaklık okuyun.
Bu test, artan glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgısını ölçerek kontrol koşulları altında test edilmiştir. Çok az salgı aktivitesi beş milimolar glukozun altında gözlenir ve salgı sekiz milimolar üzerinde artmıştır. Hücreler diazoksit paradigması ile meydan zaman beklenen salgı yanıtı sergiler.
Diazoksit tedavisi ekstrasellüler potasyum klorür yoksa insülin salgıını engeller. Potasyum klorür mevcut olduğunda, salgı glikoz daha ilavesi ile güçlendirilebilir. Ayrıca InsGLuc MIN6 hücrelerinin potasyum klorür, diazoksit, PMA ve epinefrin gibi modüle edici bileşiklerin salgılandığı gibi tepki verdiği gösterilmiştir.
Bu prosedürü takiben, kritik sonuçlar insülin konsantrasyonlarının belirlenmesine olanak sağlayan antikor bazlı ELISA veya HTRF tahlillerinde KRBH süpernatanları analiz edilerek doğrulanmalıdır. Broad Enstitüsü'ndeki bir grup tarafından bir çok öncü çalışma yapıldı, bu da araştırmamda bu titreyi giderek daha fazla kullanmamın önünü açtı. Biz ve Broad'daki grup da dahil olmak üzere birçok araştırma grubu, bu yaklaşımı diyabet alanında ilaç keşif çalışmalarında kullanmaktadır.
