이 프로토콜은 베타 세포주에서 인슐린 분비를 속이기 위한 대체적인 신속한 접근법을 설명하여 약물 발견 및 특성화를 가속화합니다. 이 접근법은 여러 치료법을 동시에 테스트할 수 있고, 실험 직후에 결과를 사용할 수 있으며, 이 분석이 다른 치료법보다 더 저렴하기 때문에 유용합니다. 인슐린 분비의 새로운 작은 분자 변조기에 대한 스크리닝을 향해이 방법의 응용 프로그램은 미래의 당뇨병 치료에 대한 납 화합물을 식별 할 수 있습니다.
베타 세포 기능에 대한 지식이 증가하면 일반적으로 단백질 이나 신경 전달 물질 분비의 더 큰 이해에 기여할 수 있습니다. 이 인슐린 분비 기자는 다른 베타 세포 라인과 인간 섬에서 렌티 바이러스 시스템에서 작동하도록 설립되었습니다. 이 분석체는 세포 배양 및 다중 채널 파이펫 을 작동하는 데 익숙한 개인에게 매우 간단해야합니다.
실험을 계획하기 전에, 당신의 부모 또는 안정적인 베타 세포주 인슐린 ELISA를 사용하여 포도 당에 제대로 반응 하는 확인. 설명서 방향에 따라 크렙스 링거 중탄산완충또는 KRBH 및 가우시아 루시파라제 작업 솔루션을 준비하는 것으로 시작합니다. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 T75 플라스크에서 MIN6 세포를 성장시하십시오.
PBS로 두 번 세포의 물풍 플라스크를 세척하고 트립신의 두 밀리리터를 추가하여 도금에 대한 InsGLuc MIN6 세포를 준비합니다. 약 5 분 동안 37섭씨또는 세포가 플라스크에서 해리 될 때까지 세포를 배양합니다. 세포 농도를 결정하고 밀리리터 당 1백만 개의 세포로 전체 매체의 세포를 희석시키는데, 이는 96웰 플레이트의 각 웰에서 100 마이크로리터 당 100, 000 세포에 해당한다.
세포는 3~4일 후에 분석에 충분히 수렴되어야 한다. 분석 당일, 실험을 위해 충분한 포도당 무료 KRBH를 준비하고 저수지를 설정합니다. 실험실 싱크대에 빠르게 반역한 다음 종이 타월 더미에 단단히 얼룩져 과도한 매체를 제거하여 96 웰 플레이트에서 배지를 데킹합니다.
잘 당 포도당 무료 KRBH의 100 마이크로 리터로 접시를 두 번 세척하고, 약물 치료를 수행하는 경우, 원고 지침에 따라 KRBH에 약물을 추가합니다. 그런 다음, 포도당 무료 KRBH의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 인큐베이션 후 버퍼를 데수늘하고 접시를 종이 타월에 블롯합니다.
100 마이크로리터의 포도당 무료 KRBH를 잘 추가하여 축적된 배경을 씻어낸 다음 접시를 데치합니다. 잘 100 마이크로 리터에서 약물 치료유무에 관계없이 제어 및 자극 조건을 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오. 주어진 실험에서 세포의 반응성을 결정하기 위해 각 플레이트에 기저 및 자극 된 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다.
세포가 시간이 지남에 따라 응답을 잃은 경우, 신선한 액체 질소 육수에서 그들을 다시 배양. 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 50 마이크로 리터의 마이크로 리터를 수집, 불투명 흰색 96 및 분석 플레이트로 전송하고, 루시파라제 분석에 대한 준비가 될 때까지 벤치에 실온에서 샘플을 유지합니다. CTZ가 온난화되는 것을 방지하기 위해 필요한 양의 CTZ 용액을 GLuc 분석 버퍼에 파이프하여 가우시아 루시파라제 분석 작업 솔루션을 준비합니다.
멀티채널 파이펫을 사용하여 KRBH 수퍼나티를 사용하여 GLuc 분석 작업 솔루션을 플레이트에 빠르게 추가합니다. 우물 측면에 액적이 있으면 테이블 탑에서 플레이트를 잠시 회전하고 버킷 원심분리기를 스윙합니다. 그런 다음 플레이트 판독기에 플레이트를 넣고 0.1초의 통합 시간으로 발광을 읽습니다.
이 분석은 증가 된 포도당 농도에 대한 응답으로 인슐린 분비를 측정하여 제어 조건하에서 테스트되었습니다. 아주 작은 분비 활동은 5 밀리몰라 포도당 의 밑에 관찰되고, 증가한 분비는 8 밀리몰라 위에 관찰됩니다. 세포는 diazoxide 패러다임에 도전할 때 예상되는 분비 반응을 전시합니다.
디아산화화물 치료는 염화칼륨 외세포 칼륨이 없는 경우 인슐린 분비를 차단합니다. 염화칼륨이 존재할 때, 분비액은 포도당을 추가하여 증폭될 수 있다. 또한 InsGLuc MIN6 세포가 염화칼륨, 다이아산화물산화물, PMA 및 에피네프린과 같은 변조 화합물을 분비할 것으로 예상되는 것으로 입증되었습니다.
이 절차에 따라, 인슐린 농도의 측정을 허용하는 항체 기반 ELISA 또는 HTRF 분석에서 KRBH 초월제를 분석하여 중요한 결과를 확인해야합니다. 선구적인 작업의 많은 브로드 연구소에서 그룹에 의해 수행되었습니다, 이는 점점 내 연구에서이 분석기를 사용하는 나를위한 길을 포장. 우리와 브로드의 그룹을 포함한 여러 연구 그룹은 당뇨병 분야에서 약물 발견 노력에이 접근 방식을 사용하고 있습니다.
