Этот протокол описывает альтернативный быстрый подход для анализа секреции инсулина от бета-клеточных линий для ускорения обнаружения и характеристики препарата. Этот подход полезен, потому что несколько методов лечения могут быть протестированы одновременно, результаты доступны сразу после эксперимента, и этот анализ является более доступным, чем другие. Применение этого метода для скрининга для новых малых модуляторов молекулы секреции инсулина может определить свинцовые соединения для будущих методов лечения диабета.
Повышенное знание функции бета-клеток может способствовать более глубокому пониманию белка или нейромедиатора секреции в целом. Этот инсулин секреции репортер был создан для работы в лентивирусной системы в других бета-клеток линий и в человеческих островков. Этот анализ должен быть очень простым для людей, знакомых с клеточной культурой и операционных многоканальные пипетки.
Прежде чем планировать какие-либо эксперименты, убедитесь, что ваши родительские или стабильные линии бета-клеток должным образом реагируют на глюкозу с помощью инсулина ELISA. Начните с подготовки Кребс-Рингер Бикарбонат Буфер или KRBH и gaussia luciferase рабочее решение в соответствии с рукописными направлениями. Выращивайте клетки MIN6 в колбы T75 с использованием стандартных методов клеточной культуры.
Подготовь клетки InsGLuc MIN6 для покрытия путем мытья стеченной колбы клеток дважды с PBS и добавить два миллилитров трипсина. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение примерно пяти минут, или до тех пор, пока клетки отмежеваться от колбы. Определите концентрацию клеток и разбавьте клетки в полных средствах массовой информации до одного миллиона клеток на миллилитр, что приравнивается к 100 000 клеток на 100 микролитров в каждом колодец из 96 пластин.
Клетки должны быть достаточно стечены для анализа через три-четыре дня. В день анализа, подготовить достаточно глюкозы бесплатно KRBH для эксперимента и создать резервуар. Декант среды из 96 хорошо пластины быстро инвертирования его над лабораторной раковиной, а затем пятно твердо на стопку бумажных полотенец, чтобы удалить избыток среды.
Вымойте пластину дважды с 100 микролитров глюкозы бесплатно KRBH на колодец, и при выполнении медикаментозного лечения, добавить препараты в KRBH в соответствии с рукописными направлениями. Затем добавьте 100 микролитров глюкозы бесплатно KRBH к каждой хорошо и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. После инкубации, decant буфера и пятно пластины на бумажное полотенце.
Добавьте 100 микролитров глюкозы бесплатно KRBH на колодец, чтобы смыть любой накопленный фон, а затем декант пластины. Добавить контроль и стимулирующие условия с или без медикаментозного лечения на 100 микролитров на колодец и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Важно включить базальные и стимулированные элементы управления на каждой пластине, чтобы определить отзывчивость клеток в данном эксперименте.
Если клетки потеряли свою реакцию с течением времени, перекультура их из свежего жидкого азота фонда. Тщательно соберите 50 микролитров супернатанта с помощью многоканальной пипетки, перенесите его в непрозрачную белую 96 хорошо анализаторную пластину, и держите образец при комнатной температуре на скамейке до готовности к анализу люциферазы. Подготовь gaussia luciferase анализ рабочего решения путем трубопроводов необходимое количество раствора КТЗ в буфер анализа GLuc, заботясь, чтобы предотвратить ЦЗЗ от потепления.
Используйте многоканальный пипетку, чтобы быстро добавить анализ GLuc рабочее решение к пластине с supernatants KRBH. Если есть какие-либо капли по бокам колодцев, кратко спина пластины в столешницу, качели ведро центрифуги. Затем положите пластину в считыватель пластины и прочитайте люминесценцию с 0,1-секундным интеграционным временем.
Этот анализ был протестирован в условиях контроля путем измерения секреции инсулина в ответ на повышение концентрации глюкозы. Очень мало секретоорийной активности наблюдается ниже пяти миллимолядней глюкозы, а повышенная секреция наблюдается выше восьми миллимоля. Клетки демонстрируют ожидаемый секреторный ответ, когда оспаривается с парадигмой диазоксида.
Лечение диазоксидом блокирует секрецию инсулина, если нет внеклеточного хлорида калия. При присутствует хлорид калия, секреция может быть усилена с дальнейшим добавлением глюкозы. Было также продемонстрировано, что клетки InsGLuc MIN6 реагируют, как и ожидалось, на секрецию, модулируя соединения, такие как хлорид калия, диазоксид, ПМА и эпинефрин.
После этой процедуры, критические результаты должны быть подтверждены путем анализа KRBH supernatants в антителах на основе ELISA или HTRF анализы, которые позволяют определить концентрации инсулина. Много новаторской работы было сделано группой в Широком институте, который проложил путь для меня, чтобы все чаще использовать этот анализ в моих исследованиях. Несколько исследовательских групп, включая нас и группу в Широком, используют этот подход в усилиях по открытию наркотиков в области диабета.
