该协议允许无缝隔离，培养和询问从C.elegans的特定细胞系的转录反应。该协议的主要优点是高度适应蠕虫的不同生命阶段或要分离的特定细胞类型。演示这个程序的将是我自己和娜塔莉亚扎海科，一个技术员从我们的实验室。
收集动物后，在1600次g下离心5分钟。取出所有上一液，并在一毫升M9介质中重新暂停蠕虫。将悬浮液转移到 1.5 毫升微离心管。
在 1600 次 g 下离心 5 分钟，以对蠕虫进行颗粒。然后加入200微升SDS-DTT缓冲液，在室温下孵育5分钟。如果用光学显微镜观察，蠕虫现在应该看起来会沿着身体起皱。
接下来，加入800微升的冰冷隔离缓冲液，轻轻轻拂管子混合。在13，000倍的g和4摄氏度的离心机一分钟，以颗粒蠕虫。取出上流液，用一毫升隔离缓冲液清洗。
重复离心和洗涤过程共五次，确保每次小心地取出隔离缓冲液。在此之后，加入100微升的蛋白酶混合物从链球菌，溶解在隔离缓冲液，到颗粒。在室温下孵育10至15分钟，确保通过用200微升微管尖端对管底部进行60至70次上下移液，进行机械干扰。
要确定消化阶段，请取出一至五微升的消化混合物，将其滴到玻璃滑梯上，并使用组织培养显微镜进行检查。五到七分钟后，蠕虫碎片的角质层应该明显减少，细胞的泥浆很容易看到。通过添加900微升的市售莱博维茨的L-15介质，辅以10%FBS和青霉素链霉素，停止反应。
在10，000倍g和4摄氏度下离心5分钟，以颗粒分离的碎片和细胞。每次洗涤使用一毫升介质用冷L-15补充介质再清洗两次颗粒细胞。将颗粒细胞重新在一毫升L-15补充介质中，在冰上离开30分钟。
然后采取顶层，这是大约700至800微升，并转移到微离心管。使用自动细胞计数器或血度计测量10至25微升的分离细胞的细胞密度。分离细胞悬浮液中的离心细胞在10，000倍g和4摄氏度下悬浮5分钟。
丢弃上流液，重新在L-15补充介质中重新增殖颗粒细胞，其细胞密度不超过每毫升600万个细胞，以避免流式细胞计过载。然后，使用能够对样品进行排序的流动细胞计，使用 GFP 阳性表达式对细胞进行排序。GFP 阴性细胞可用作非细胞类型特定分析的控件。
之后，将分离的细胞板放入无菌六孔板的孔中，将板放入塑料容器中，加入湿巾或软纸巾，为细胞添加水分，并在20摄氏度下孵育。分离细胞悬浮液中的离心细胞在1.5毫升无RNase微离心管中，温度为10，000倍g，在4摄氏度下5分钟。使用微移子，去除上一杯，并添加100微升的M9介质，洗去L-15补充介质。
接下来，将细胞在10000倍g和4摄氏度下离心5分钟，取出上光。重复此洗涤和离心过程三次，以确保所有介质都已移除，确保每次小心地去除上经。然后，在细胞中加入一毫升酚和瓜尼丁同位素解，并小心地将悬浮液上下移液。
在室温下孵育混合物五分钟。在此之后，加入250微升氯仿，轻轻反转管15至20次。在室温下孵育五分钟。
在10，000倍g和25摄氏度的离心机5分钟。使用微管小心地去除尽可能多的顶部水层，确保不打扰底部有机层。将底层转移到新的 1.5 毫升无 RNase 微离心管。
到新管，加入500微升异丙醇，通过倒置管混合。在室温下孵育此溶液五分钟。然后在14，000次g和25摄氏度下将管离心20分钟。
将样品放在冰上，并使用微管去除尽可能多的异丙醇。将无 RNase 双蒸馏水中一毫升 70% 乙醇轻轻加入管中，将其涂抹到管的一侧。在10，000倍g和25摄氏度的离心机5分钟。
取出大部分乙醇，让管子在冰上风干三到五分钟。在此之后，加入15至20微升无RNase双蒸馏水。使用 260 纳米的分光光度计测量 RNA 浓度和纯度。
在这项研究中，未-17:GFP阳性胆碱性神经元被提取，并从圆虫C.elegans中提取和分离，以便随后进行体外研究。unc-17基因在C.elegans体内表达，并编码为车辆乙酰胆碱跨膜运输器。这种基因的表达可以在头部、中半身和尾部神经元以及神经元投影中观察到。
此处显示了分离后uns-17:GFP阳性神经元的代表性荧光微图，以及未修改的N2野生类动物的各负控制。当与莱博维茨的L-15介质和10%FBS补充时，分离的细胞可以存活长达三天。此处显示了来自 GFP 表达胆碱性神经元以及 GFP 表达肌肉细胞的 qPCR 代表性数据。
成功分选细胞后，通过苯酚和瓜尼丁同位素方法分离RNA，然后使用合成试剂盒生产cDNA。胆碱神经元特异性基因，tph-1，色氨酸羟基酶，和snb-1，突触囊泡运输器，在uns-17:GFP分离细胞中升高。但是，此表达式并不存在于 myo-3:GFP 分离细胞中。
与肌-2的肌肉特异性肌素重链记录表达相反，因为这种基因的表达仅限于孤立的肌肉细胞，而不是分离的胆碱细胞。充分孵化蠕虫非常重要。然而，蠕虫角质层的延长孵育可能导致蠕虫死亡或给动物额外的压力。
分离后，细胞可以培养一段时间，也可以用于RNA分离和qRT-PCR分析。培养神经元可以通过贴片夹电泳测量进一步分析。这种技术可能有助于对特定细胞群进行体外分析，从而有助于我们更好地了解多细胞生物在其生命周期不同阶段的细胞特异性反应。
由于本实验使用 SDS 和 DTT 等化学品，因此在制造和使用缓冲液时应遵循一般实验室安全程序。
