Bu protokol, C.elegans'tan belirli bir hücre soyundan transkripsiyonel yanıtların sorunsuz bir şekilde izole edilmesine, kültüre edilmesine ve sorgulanmasına olanak sağlar. Bu protokolün en büyük avantajı solucanların veya izole edilecek belirli hücre türlerinin farklı yaşam aşamalarına yüksek düzeyde adaptasyon olmasıdır. Prosedürü gösteren ben ve Nataliya Zahayko, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
Hayvanları topladıktan sonra, beş dakika boyunca 1600 kez g santrifüj. Tüm supernatant çıkarın ve M9 medya bir mililitre solucanlar resuspend. Süspansiyonu 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Solucanları peletlemek için 5 dakika boyunca 1600 kez g santrifüj. Daha sonra 200 mikrolitre SDS-DTT tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Solucanlar şimdi bir ışık mikroskop altında bakıldığında vücut boyunca kırışık gibi görünmelidir.
Daha sonra, 800 mikrolitre buz gibi izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe hareket ettirerek karıştırın. 13, 000 kez g ve dört santigrat derecede bir dakika solucanları pelet için santrifüj. Supernatant çıkarın ve izolasyon tampon bir mililitre ile yıkayın.
Santrifüj ve yıkama işlemini toplam beş kez tekrarlayın ve her seferinde izolasyon arabelleği dikkatlice çıkardığından emin olun. Bundan sonra, streptomyces griseus proteaz karışımı 100 mikrolitre ekleyin, izolasyon tampon içinde çözünmüş, pelet. 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka, tüpün altına karşı 200 mikrolitrelik mikropipet ucu ile 60-70 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak mekanik bozulma uygulamak için emin olun.
Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımı nın bir ila beş mikrolitresini çıkarın, cam bir kaydıranın üzerine bırakın ve doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin. Beş ila yedi dakika sonra, solucan parçaları gözle görülür bir şekilde azaltılmış bir manikür ve hücrelerin bir bulamaç kolayca görünür olmalıdır. Ticari olarak mevcut Leibovitz's L-15 orta 900 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun, ile takviye 10%FBS ve penisilin-streptomisin.
10, 000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca izole parçalar ve hücreler pelet santrifüj. Peletli hücreleri, yıkama başına bir mililitre ortam kullanarak soğuk L-15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın. L-15 takviyeli medya bir mililitre peletli hücreleri resuspend, ve 30 dakika buz üzerinde bırakın.
Sonra yaklaşık 700 ila 800 mikrolitre olan üst katmanı alın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İzole hücrelerin 10 ila 25 mikrolitre hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemacytometre kullanın. İzole hücre süspansiyonundaki santrifüj hücreleri 10, 000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika süreyle.
Süpernatant atın ve akış sitometre aşırı yüklemeönlemek için mililitre başına en fazla altı milyon hücre nin bir hücre yoğunluğuna L-15 takviyeli orta peletli hücreleri yeniden askıya. Ardından, örnekleri sıralama yeteneğine sahip bir akış sitometrekullanarak hücreleri GFP pozitif ifadesine göre sıralayın. GFP-negatif hücreler hücre tipine özgü olmayan analizler için bir kontrol olarak kullanılabilir.
Bundan sonra, steril altı kuyulu bir plaka kuyularına izole hücreleri plaka, plastik bir kap içine plaka yerleştirin, hücrelere nem eklemek için nemli bir silme veya yumuşak doku kağıt ekleyin ve 20 santigrat derece kuluçka. 10, 000 kez g ve beş dakika boyunca dört derece santigrat bir 1.5 mililitrelik RNase-free mikrosantrifüj tüp izole hücre süspansiyon santrifüj hücreleri. Bir mikropipet kullanarak, supernatant çıkarın ve L-15 takviyeli orta yıkamak için M9 orta 100 mikrolitre ekleyin.
Sonra, hücreleri 10,000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatant çıkarın. Tüm ortamkaldırılır emin olmak için bu yıkama ve santrifüj işlemi toplam üç kez tekrarlayın, dikkatle her zaman supernatant kaldırmak için emin olun. Sonra, hücrelere fenol ve guanidin izolat çözeltisi bir mililitre ekleyin ve pipet süspansiyon yukarı ve aşağı dikkatle.
Karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kloroform 250 mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp 15-20 kez ters. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
Santrifüj 10, 000 kez g ve 25 santigrat derecede beş dakika. Alt takiorganik katmanları rahatsız etmemek için üstteki sulu tabakanın mümkün olduğunca büyük bir kısmını dikkatlice çıkarmak için bir mikropipet kullanın. Alt katmanı yeni bir 1,5 mililitrelik RNase içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Yeni tüp için, isopropanol 500 mikrolitre ekleyin ve tüp ters çevirerek karıştırın. Bu çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra tüpü 14, 000 kez g ve 25 derecede 20 dakika santrifüj edin.
Buz üzerinde örnekleri yerleştirin ve mümkün olduğunca çok isopropanol kaldırmak için bir mikropipet kullanın. Tüp tarafına uygulayarak tüpe rnase içermeyen çift distile suya %70 etanol mililitre hafifçe ekleyin. Santrifüj 10, 000 kez g ve 25 santigrat derecede beş dakika.
Etanolün çoğunu çıkarın ve tüpün buzda üç ila beş dakika kurumasını bekleyin. Bundan sonra, 15 ila 20 mikrolitre RNase içermeyen çift distile su ekleyin. RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçmek için 260 nanometrede bir spektrofotometre kullanın.
Bu çalışmada, unc-17:GFP-pozitif kolinerjik nöronlar ayıklanır ve sonraki ex vivo çalışmalar için yuvarlak solucan C.elegans izole edilir. Unc-17 geni C.elegans gövdesi boyunca ifade edilir, vevesiküler asetilkolin transmembran taşıyıcı için kodları. Bu genin ekspresyonu baş görülebilir, orta vücut, ve kuyruk nöronlar, ve nöron projeksiyonları.
İzolasyon sonrası unc-17:GFP-pozitif nöronların temsili floresan mikrografları ve değiştirilmemiş N2 yabani hayvanların negatif kontrolü burada gösterilmiştir. İzole hücreler Leibovitz'in L-15 orta ve %10 FBS ile takviye edildiğinde üç güne kadar hayatta kalabilirler. GFP ifade eden kolinerjik nöronlardan qPCR'nin temsili verileri ve GFP ifade eden kas hücreleri burada gösterilmiştir.
Hücreleri başarıyla sıraladıktan sonra RNA fenol ve guanidin iyotiyosiyanat yöntemi ile izole edilir, bundan sonra cDNA bir sentez kiti kullanılarak üretilir. Kolinerjik nöron spesifik genlerin ekspresyonu, tph-1, triptofan hidroksilaz, ve snb-1, bir sinaptik vezikül taşıyıcı, unc-17:GFP izole hücrelerde yükselir. Ancak, bu ifade myo-3:GFP yalıtılmış hücrelerde bulunmaz.
Ters miyo-2 kas spesifik miyozin ağır zincir transkript ifadesi ile doğrudur, Bu genin ekspresyonu izole kas hücreleri ile sınırlıdır gibi, ama izole kolinerjik hücreler. Solucanları tamamen kuluçkaya yatırmak önemlidir. Ancak, solucan kütikülünün uzun süreli kuluçka sıcağı solucan ölümüne veya hayvana ek strese neden olabilir.
İzolasyondan sonra, hücreler bir süre kültürlenebilir veya RNA yalıtımı ve qRT-PCR analizi için kullanılabilir. Kültürlü nöronlar yama kıskaç elektroforez ölçümleri ile daha fazla analiz edilebilir. Bu teknik, belirli hücre gruplarının ex vivo analizini kolaylaştırarak, yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarında çok hücreli organizmalar bağlamında hücreye özgü tepkileri anlamamızı geliştirmeye yardımcı olabilir.
Bu deney sırasında SDS ve DTT gibi kimyasallar kullanıldığından, tampon yapımı ve kullanımı sırasında genel laboratuvar güvenlik prosedürleri izlenmelidir.
