Этот протокол позволяет бесшовной изоляции, культивирования и допроса транскрипционных ответов в конкретной линии клеток от C.elegans. Основным преимуществом этого протокола является высокий уровень адаптации к различным стадиям жизни червей или конкретных типов клеток, которые должны быть изолированы. Демонстрацией процедуры будет я и Наталья Захайко, техник из нашей лаборатории.
После сбора животных, центрифуга их на 1600 раз г в течение пяти минут. Удалите все супернатанты и повторно помесить червей в один миллилитр M9 средств массовой информации. Перенесите подвеску в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Центрифуга в 1600 раз г в течение пяти минут, чтобы гранулировать червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DTT и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Черви теперь должны казаться морщинистыми вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
Далее добавьте 800 микролитров ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкивая трубку. Центрифуга при 13 000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты, чтобы гранулировать червей. Удалить супернатант и промыть одним миллилитром буфера изоляции.
Повторите процесс центрифугации и мытья в общей сложности пять раз, убедившись, что тщательно удалить буфер изоляции каждый раз. После этого добавьте в гранулы 100 микролитров протеазной смеси из Streptomyces griseus, растворенных в буфере изоляции. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут, убедившись, что применять механические нарушения путем трубопроводов вверх и вниз от 60 до 70 раз с 200-микролитер микропипетр кончиком против нижней части трубки.
Чтобы определить стадию пищеварения, удалите от одного до пяти микролитров смеси пищеварения, опустите его на стеклянную горку и осмотрите с помощью микроскопа культуры тканей. Через пять-семь минут фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу, и навоз клеток будет легко виден. Остановите реакцию, добавив 900 микролитров коммерчески доступных L-15 среды Лейбовица, дополненный 10%FBS и пенициллин-стрептомицин.
Центрифуга при 10 000 раз г и при четырех градусах По Цельсию в течение пяти минут гранулировать изолированные фрагменты и клетки. Вымойте гранулы клетки в два раза больше с холодной L-15 дополнительных средств массовой информации с использованием одного миллилитра средств массовой информации на стирку. Переусердуйте гранулы клеток в один миллилитр L-15 дополнительных средств массовой информации, и оставить на льду в течение 30 минут.
Затем возьмите верхний слой, который составляет примерно от 700 до 800 микролитров, и перенесите его в трубку микроцентрифуга. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемацитометр для измерения плотности клеток от 10 до 25 микролитров изолированных клеток. Центрифуги клетки из изолированной клеточной суспензии при 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и будем повторно использовать гранулы клеток L-15, дополнив их плотностью не более шести миллионов клеток на миллилитр, чтобы избежать перегрузки цитометра потока. Затем сортируют клетки по GFP-положительному выражению с помощью цитометра потока, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве элемента управления для анализа, не тип клетки.
После этого, пластины изолированных клеток в колодцы стерильной пластины шесть скважин, поместите пластину в пластиковый контейнер, добавить влажную салфетку или мягкую бумагу ткани, чтобы добавить влагу в клетки, и инкубировать при 20 градусов по Цельсию. Клетки центрифуги из изолированной клеточной подвески в 1,5-миллилитровой микроцентрифуге без RNase в 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используя микропипют, удалите супернатант и добавьте 100 микролитров среды M9, чтобы смыть L-15 дополненной среды.
Затем центрифуга клетки на 10000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и удалить супернатант. Повторите этот процесс мытья и центрифугации в три раза больше, чтобы убедиться, что все средства массовой информации удаляется, убедившись, что тщательно удалить супернатант каждый раз. Затем добавьте один миллилитр фенола и гуанидина изотиоцианат раствора в клетки и пипетки подвески вверх и вниз тщательно.
Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. После этого добавьте 250 микролитров хлороформа и аккуратно инвертировать трубку от 15 до 20 раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Используйте micropipette тщательно удалить как можно больше верхнего aqueous слой, как это возможно, убедившись, что не беспокоить нижней органических слоев. Перенесите нижний слой в новую микроцентрифугную трубку без 1,5 миллилитров RNase.
К новой трубке добавьте 500 микролитров изопропанола и перемешайте трубку. Инкубировать этот раствор при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифуга трубки на 14000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Поместите образцы на лед и используйте микропипюту, чтобы удалить как можно больше изопропанола. Аккуратно добавьте один миллилитр 70% этанола в RNase-бесплатно двойной дистиллированной воды в трубку, применяя его в сторону трубки. Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Удалите большую часть этанола и дайте трубке высохнуть на льду в течение трех-пяти минут. После этого добавьте от 15 до 20 микролитров воды без RNase. Используйте спектрофотометр на 260 нанометров для измерения концентрации и чистоты РНК.
В этом исследовании, unc-17:GFP-положительные холинергические нейроны извлекаются и изолированы от круглого червя C.elegans для последующих исследований ex vivo. Ген unc-17 выражен по всему телу C.elegans, и коды для везикулярного ацетилхолина трансмембранного транспортера. Выражение этого гена можно наблюдать в головах, середине тела и хвостовых нейронах, а также в проекциях нейронов.
Здесь показаны репрезентативные микрографы флуоресценции некон-17:GFP-положительных нейронов после изоляции, а также соответствующий отрицательный контроль со стороны неизмененных животных N2 дикого типа. Изолированные клетки могут оставаться в живых до трех дней, когда дополняется L-15 Лейбовица среднего и 10%FBS. Здесь показаны репрезентативные данные qPCR от GFP-экспрессинг холинергических нейронов, а также GFP-экспрессинговых мышечных клеток.
После успешной сортировки клеток РНК изолируются с помощью метода фенола и гуанидина изотиоцианата, после чего кДНК вырабатывается с помощью синтеза. Выражение холинергических нейронов конкретных генов, tph-1, триптофан гидроксилазы, и snb-1, синаптический транспортер пузырьков, поднимается в unc-17:GFP изолированных клеток. Однако это выражение не присутствует в изолированных клетках myo-3:GFP.
Обратное верно с выражением мышечно-специфической миозин-тяжелой цепи стенограммы мио-2, так как экспрессия этого гена ограничивается изолированными мышечными клетками, но не изолированными холинергическими клетками. Важно, чтобы инкубировать червей в полном объеме. Однако, расширенная инкубация кутикулы червя может привести к смерти червя или дополнительного стресса для животного.
После изоляции, клетки могут быть либо культурны в течение определенного периода времени, или использоваться для изоляции РНК и qRT-PCR анализа. Культурные нейроны могут быть дополнительно проанализированы с помощью измерений электрофорезного зажима патча. Этот метод может облегчить анализ ex vivo конкретных групп клеток, тем самым помогая улучшить наше понимание клеточных реакций в контексте многоклеточных организмов на различных этапах своего жизненного цикла.
Поскольку в ходе этого эксперимента используются такие химические вещества, как SDS и DTT, следует соблюдать общие лабораторные процедуры безопасности при создании и использовании буферов.
