이 프로토콜은 C.elegans의 특정 세포 혈통에서 전사 반응의 원활한 격리, 배양 및 심문을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 격리될 웜 또는 특정 세포 유형의 다른 수명 단계에 대한 높은 수준의 적응성입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 나탈리야 자하이코 (Nataliya Zahayko)가 될 것입니다.
동물을 수집 한 후 원심 분리는 5 분 동안 1600 배 g로 분리합니다. 모든 상체를 제거하고 M9 미디어의 한 밀리리터에서 웜을 다시 일시 중지합니다. 서스펜션을 1.5밀리터 마이크로센심분리기 튜브로 이송합니다.
원심분리기는 벌레를 펠릿하는 데 5분 동안 1600배 g의 원심분리기. 그런 다음 SDS-DTT 버퍼 200 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 지금 가벼운 현미경의 밑에 보는 경우에 바디를 따라 주름이 있는 것처럼 보일 것입니다.
다음으로, 얼음 차가운 절연 버퍼 800 마이크로리터를 넣고 튜브를 부드럽게 가볍게 가볍게 섞습니다. 원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 1분간 벌레를 배출합니다. 상체를 제거하고 절연 버퍼 1 밀리리터로 세척합니다.
원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 격리 완충액에 용해된 연쇄상 구균에서 프로테아제 혼합물 100마이크로리터를 펠릿에 넣습니다. 10~15분 동안 실온에서 배양하여 튜브 바닥에 200마이크로리터 마이크로피펫 팁으로 60~70회 위아래로 파이프를 사용하여 기계적 중단을 적용해야 합니다.
소화의 단계를 결정하기 위해 소화 혼합물의 1 ~ 5 마이크로 리터를 제거하고 유리 슬라이드에 떨어 뜨리고 조직 배양 현미경을 사용하여 검사하십시오. 5~7분 후에, 벌레 단편은 눈에 띄게 감소된 표피를 가져야 하고 세포의 슬러리가 쉽게 보일 것입니다. 10%의 FBS와 페니실린 연쇄 절제술을 보충한 상용 Leibovitz의 L-15 배지의 900 마이크로리터를 추가하여 반응을 중단하십시오.
원심분리기는 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 분리된 단편과 세포를 펠릿합니다. 차가운 L-15 보충 매체로 펠릿 세포를 두 번 더 씻는다. L-15 보충 된 매체의 1 밀리리터에서 펠릿 세포를 다시 중단하고 30 분 동안 얼음에 둡니다.
그런 다음 약 700 ~800 마이크로리터인 상단 층을 가져 가서 마이크로 센심 분리튜브로 옮김하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 패혈계를 사용하여 격리 된 세포의 10 ~ 25 마이크로 리터의 세포 밀도를 측정합니다. 분리된 세포 현탁액으로부터의 원심분리기 세포는 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분 동안.
수퍼네티드를 버리고 L-15의 펠렛 세포를 밀리리터당 600만 세포 이하의 세포 밀도로 보충하여 유동 세포계의 과부하를 피한다. 그런 다음 샘플을 정렬할 수 있는 유동 사이토미터를 사용하여 GFP 양성 식으로 세포를 정렬합니다. GFP-음성 세포는 비세포 유형 별 분석을 위한 대조군으로 사용될 수 있다.
그 후, 격리된 세포를 멸균 6웰 플레이트의 우물에 접시를 놓고, 접시를 플라스틱 용기에 넣고, 젖은 닦기 또는 연조직 용지를 추가하여 세포에 수분을 추가하고, 섭씨 20도에서 배양한다. 1.5 밀리리터 RNase 프리 마이크로센트 심분리기 튜브에서 분리 된 세포 현탁액에서 원심 분리 기 세포는 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 5 분 동안. 마이크로 파이프를 사용하여 상체를 제거하고 M9 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하여 L-15 보충 매체를 씻어 내도록합니다.
다음으로, 세포를 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상체를 제거합니다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 총 3회 반복하여 모든 미디어가 제거되도록 매번 상퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 페놀과 구아니딘 이소티오카네이트 용액 1밀리리터를 세포에 넣고 서스펜션을 조심스럽게 위아래로 피펫합니다.
5 분 동안 실온에서 혼합물을 배양. 그 후, 클로로폼 250 마이크로리터를 추가하고 튜브를 15~20회 부드럽게 반전시면 됩니다. 실온에서 5분간 배양하세요.
원심분리기는 10, 000배, 섭씨 25도에서 5분간. 마이크로파이프를 사용하여 가능한 한 많은 위 수성 층을 조심스럽게 제거하여 하단 유기 층을 방해하지 않도록 하십시오. 바닥 층을 새로운 1.5 밀리리터 RNase 프리 마이크로 센세이처유 튜브로 옮기십시오.
새로운 튜브에 이소프로판올 500 마이크로리터를 넣고 튜브를 반전시켜 섞습니다. 이 솔루션을 실온에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 튜브를 14, 000배, 섭씨 25도에서 20분 동안 원심분리합니다.
샘플을 얼음 위에 놓고 마이크로 파이프를 사용하여 가능한 한 많은 이소프로파놀을 제거하십시오. 튜브 측면에 적용하여 RNase 가 없는 이중 증류수에 70%에탄올 1밀리리터를 튜브에 부드럽게 넣습니다. 원심분리기는 10, 000배, 섭씨 25도에서 5분간.
에탄올의 대부분을 제거하고 튜브가 얼음에 공기 건조하게 3 ~ 5 분. 그 후, RNase 가 없는 이중 증류수 15~20마이크로리터를 추가합니다. RNA 농도 및 순도를 측정하기 위해 260 나노미터에서 분광계를 사용합니다.
이 연구에서는, unc-17:GFP 양성 콜린성 뉴런추출 하 고 후속 ex vivo 연구에 대 한 둥근 벌레 C.elegans에서 격리. unc-17 유전자는 C.elegans 바디를 통해, 및 vesicular 아세틸콜린 막 수송에 대한 코드에 걸쳐 표현됩니다. 이 유전자의 발현은 머리, 중간 체 및 꼬리 뉴런 및 뉴런 투영에서 관찰될 수 있다.
분리 후 Unc-17:GFP 양성 뉴런의 대표적인 형광 현미경 및 수정되지 않은 N2 야생 형 동물의 각각의 부정적인 제어가 여기에 나와 있습니다. 라이보비츠의 L-15 배지와 10%의 FBS로 보충하면 격리된 세포는 최대 3일까지 살아남을 수 있습니다. GFP 발현 식 콜린 뉴런뿐만 아니라 GFP 발현 근육 세포로부터 qPCR의 대표적인 데이터가 여기에 나와 있다.
세포를 성공적으로 선별한 후, RNA는 페놀 및 구아니딘 이소티오카네이트 방법을 통해 분리되며, 그 후 cDNA는 합성 키트를 사용하여 생성되었다. 콜린성 뉴런 특이적 유전자, tph-1, 트립토판 하이드록실라제 및 시냅스 소포 수송기인 스네브-1의 발현은 unc-17:GFP 절연 세포에서 상승된다. 그러나, 이 발현은 근-3:GFP 절연 세포에 존재하지 않는다.
역은 근생-2의 근육 특이적 미신-헤비 사슬 녹취록의 발현과 함께 사실이며, 이 유전자의 발현은 고립된 근육 세포로 제한되지만, 고립된 콜린세포는 아니다. 웜을 완전히 인큐베이팅하는 것이 중요합니다. 그러나, 벌레 큐티클의 확장 된 잠복은 동물에 웜 죽음 또는 추가 스트레스를 초래할 수 있습니다.
격리 후, 세포는 시간 동안 배양되거나 RNA 격리 및 qRT-PCR 분석을 위해 사용될 수 있다. 배양된 뉴런은 패치 클램프 전기전도 측정에 의해 더 분석될 수 있다. 이 기술은 세포의 특정 단의 ex vivo 분석을 용이하게 할 수 있습니다, 따라서 그것의 수명 주기의 다양 한 단계에서 다세포 유기체의 맥락에서 세포 특정 응답의 우리의 이해를 향상 하는 데 도움이.
이 실험 중에 SDS 및 DTT와 같은 화학 물질이 사용되므로 버퍼를 만들고 사용하는 동안 일반적인 실험실 안전 절차를 따라야 합니다.
