Ce protocole permet l’isolement sans faille, la culture et l’interrogation des réponses transcriptionnelles dans une lignée cellulaire spécifique de C.elegans. Le principal avantage de ce protocole est le niveau élevé d’adaptabilité aux différents stades de vie des vers ou des types de cellules spécifiques à isoler. La démonstration de la procédure sera moi-même et Nataliya Zahayko, un technicien de notre laboratoire.
Après avoir recueilli les animaux, centrifugez-les à 1600 fois g pendant cinq minutes. Enlevez tous les supernatants et réutilisez les vers en un millilitre de médias M9. Transférer la suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugeuse à 1600 fois g pendant cinq minutes pour pelleter les vers. Ajouter ensuite 200 microlitres de tampon SDS-DTT et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Les vers devraient maintenant sembler froissés le long du corps s’ils sont vus au microscope léger.
Ensuite, ajoutez 800 microlitres de tampon d’isolement glacé et mélangez en faisant glisser doucement le tube. Centrifugeuse à 13 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant une minute pour pelleter les vers. Retirer le surnatant et laver avec un millilitre de tampon d’isolement.
Répétez la centrifugation et lavez le processus un total de cinq fois, en vous assurant d’enlever soigneusement le tampon d’isolement à chaque fois. Après cela, ajouter 100 microlitres de mélange de protéase de Streptomyces griseus, dissous dans le tampon d’isolement, à la pastille. Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, en s’assurant d’appliquer une perturbation mécanique en évadant de haut en bas 60 à 70 fois avec une pointe de micropipette de 200 microlitres contre le fond du tube.
Pour déterminer le stade de la digestion, retirez un à cinq microlitres du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l’aide d’un microscope à culture tissulaire. Après cinq à sept minutes, les fragments de ver devraient avoir une cuticule visiblement réduite et une boue de cellules sera facilement visible. Arrêtez la réaction en ajoutant 900 microlitres de L-15 moyen de Leibovitz disponible dans le commerce, complétés par 10 % de FBS et de pénicilline-streptomycine.
Centrifugeuse à 10 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour granuler des fragments et des cellules isolés. Lavez les cellules granulées deux fois plus avec du l-15 froid complété par les médias à l’aide d’un millilitre de médias par lavage. Resuspendez les cellules granulées dans un millilitre de L-15 médias complétés, et laisser sur la glace pendant 30 minutes.
Ensuite, prenez la couche supérieure, qui est d’environ 700 à 800 microlitres, et le transférer dans un tube de microcentrifugeuse. Utilisez un compteur cellulaire automatisé ou un hémacytomètre pour mesurer la densité cellulaire de 10 à 25 microlitres de cellules isolées. Cellules centrifugeuses de la suspension cellulaire isolée à 10 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez les cellules granulées dans le milieu complété L-15 à une densité cellulaire d’au plus six millions de cellules par millilitre pour éviter de surcharger le cytomètre d’écoulement. Ensuite, trier les cellules par expression GFP-positive à l’aide d’un cytomètre d’écoulement capable de trier les échantillons. Les cellules gfp-négatives peuvent être utilisées comme un contrôle pour l’analyse non spécifique au type de cellule.
Après cela, plaquez les cellules isolées dans les puits d’une plaque stérile de six puits, placez la plaque dans un récipient en plastique, ajoutez un lingette humide ou du papier de soie mou pour ajouter de l’humidité aux cellules, et incubez à 20 degrés Celsius. Cellules centrifugeuses de la suspension cellulaire isolée dans un tube de microcentrifugeuse sans RNase de 1,5 millilitre à 10 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’une micropipette, retirer le supernatant et ajouter 100 microlitres de M9 moyen pour laver le milieu complété L-15.
Ensuite, centrifugez les cellules à 10 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirez le supernatant. Répétez ce processus de lavage et de centrifugation trois fois au total pour vous assurer que tous les supports sont enlevés, en vous assurant d’enlever soigneusement le supernatant à chaque fois. Ensuite, ajouter un millilitre de phénol et guanidine solution isothiocyanate aux cellules et pipette la suspension de haut en bas avec soin.
Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Après cela, ajouter 250 microlitres de chloroforme et inverser doucement le tube 15 à 20 fois. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Centrifugeuse à 10 000 fois g et à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez une micropipette pour enlever soigneusement autant de la couche aqueuse supérieure que possible, en vous assurant de ne pas déranger les couches organiques inférieures. Transférer la couche inférieure dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sans RNase de 1,5 millilitre.
Au nouveau tube, ajouter 500 microlitres d’isopropanol et mélanger en inversant le tube. Incuber cette solution à température ambiante pendant cinq minutes. Puis centrifugez le tube à 14 000 fois g et à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Placez les échantillons sur la glace et utilisez une micropipette pour enlever autant d’isopropanol que possible. Ajouter délicatement un millilitre de 70 % d’éthanol dans de l’eau double distillée sans RNase au tube en l’appliquant sur le côté du tube. Centrifugeuse à 10 000 fois g et à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Retirer la majeure partie de l’éthanol et laisser sécher l’air du tube sur la glace pendant trois à cinq minutes. Après cela, ajouter 15 à 20 microlitres d’eau double distillée sans RNase. Utilisez un spectrophotomètre à 260 nanomètres pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN.
Dans cette étude, les neurones cholinergiques unc-17:GFP-positifs sont extraits et isolés du ver rond C.elegans pour des études ex vivo ultérieures. Le gène unc-17 est exprimé dans tout le corps de C.elegans, et les codes pour un transporteur vésiculaire de transmembrane d’acétylcholine. L’expression de ce gène peut être observée dans la tête, le corps moyen, et les neurones de queue, et les projections de neurones.
Des micrographes représentatifs de fluorescence des neurones unc-17:GFP-positifs après isolement, aussi bien qu’un contrôle négatif respectif des animaux sauvages non modifiés de type N2, sont montrés ici. Les cellules isolées peuvent rester en vie jusqu’à trois jours lorsqu’elles sont complétées par le L-15 moyen de Leibovitz et 10% FBS. Des données représentatives du qPCR provenant de neurones cholinergiques exprimant le GFP, ainsi que de cellules musculaires exprimant le GFP, sont présentées ici.
Après avoir trié avec succès les cellules, l’ARN est isolé par l’intermédiaire d’une méthode d’isothiocyanate de phénol et de guanidine, après quoi cDNA a été produit à l’aide d’un kit de synthèse. L’expression des gènes neuronaux cholinergiques spécifiques, tph-1, hydroxylase de tryptophane, et bns-1, un transporteur synaptique de vésicule, est élevée dans les cellules isolées unc-17:GFP. Cependant, cette expression n’est pas présente dans les cellules isolées myo-3:GFP.
L’inverse est vrai avec l’expression de la transcription de la chaîne myosine-lourde spécifique au muscle du myo-2, car l’expression de ce gène est limitée aux cellules musculaires isolées, mais pas aux cellules cholinergiques isolées. Il est important d’incuber complètement les vers. Cependant, l’incubation prolongée de la cuticule vermifuge peut entraîner la mort du ver ou un stress supplémentaire pour l’animal.
Après l’isolement, les cellules peuvent être cultivés pendant un certain temps, ou utilisées pour l’isolement de l’ARN et l’analyse qRT-PCR. Les neurones cultivés peuvent être analysés plus avant par des mesures d’électrophoresis de pince de correction. Cette technique pourrait faciliter l’analyse ex vivo de groupes spécifiques de cellules, contribuant ainsi à améliorer notre compréhension des réponses spécifiques aux cellules dans le contexte d’organismes multicellulaires à différents stades de son cycle de vie.
Comme des produits chimiques tels que le SDS et la TNT sont utilisés au cours de cette expérience, les procédures générales de sécurité en laboratoire devraient être suivies lors de la fabrication et de l’utilisation de tampons.
